PAFR對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響及機制研究

俞 弋，叢 青，徐叢劍，姜 偉

復旦大學附屬婦產科醫院婦科，上海 200011

卵巢癌是女性生殖系統中死亡率最高的一種惡性腫瘤。起病隱匿，缺乏早期有效的診斷方法，病理學類型復雜，預后較差［1］。目前卵巢癌的治療方式仍是手術及術后輔助鉑類藥物為主的化療，但易出現化療耐藥及轉移復發［2］。炎癥微環境對惡性腫瘤的發生、發展及轉移至關重要。血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）作為迄今為止發現的內源性生物活性最強的一種磷脂類炎性因子，與PAF受體（PAF receptor，PAFR）結合后參與體內多種生理病理學過程［3-5］。

本課題組的前期研究［6］發現，PAFR在上皮性卵巢癌組織及細胞系中高表達，PAF能明顯刺激PAFR陽性的卵巢癌細胞系增殖及侵襲。此外，在構建的裸鼠卵巢癌腹腔種植瘤模型中給予順鉑（cisplatin，CDDP）和（或）銀杏內酯B（PAFR特異性拮抗劑），結果顯示，銀杏內酯B具有體內抑制卵巢癌的作用，并可增強腫瘤細胞對于CDDP的敏感性［7］。但相關機制尚不明確。本研究將在前期研究的基礎上，探索CDDP作用后的卵巢癌細胞中PAFR的表達對卵巢癌細胞CDDP敏感性的影響，并探討相關分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞系及主要試劑

漿液性卵巢癌細胞系SKOV-3和乳突狀卵巢腺癌細胞系CAOV-3購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，CDDP、PAF和WEB2086（PAFR抑制劑）購自美國Sigma-Aldrich公司，兔抗人PAFR抗體購自美國Abcam公司，兔抗人phospho/total-ERK/AKT/P70S6K抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 蛋白質印跡法（Western blot）檢測

收集各組細胞蛋白，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離細胞裂解物并轉移至硝酸纖維素膜上。溫育一抗，4 ℃過夜，加入對應的二抗溫育1 h，再次洗膜后加入熒光發光液檢測。各組實驗中涉及同一種蛋白的磷酸化及非磷酸化狀態及內參蛋白是采用膜再生液洗膜的方法。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

使用TRIzol試劑從不同實驗組卵巢癌細胞系中提取總RNA。將提取的RNA在紫外分光光度計下檢測，讀取260 nm波長處的吸光度（D）值及D260nm/D280nm比值，將RNA反轉錄合成cDNA。PCR程序：94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個循環；然后72 ℃延伸10 min。通過2-ΔΔCt法計算各組mRNA的表達量并進行比較分析。

1.4 細胞增殖檢測

采用MTT法檢測PAFR抑制劑對卵巢癌細胞系CDDP敏感性的影響。調整細胞密度為1×104個/mL接種到96孔板中。不同實驗組及對照組細胞在37 ℃下溫育72 h后，向每孔中加入MTT溶液（5 mg/mL），并將96孔板在37 ℃下再溫育4 h。使用多孔掃描分光光度計測量490 nm波長處的D值。實驗重復3次。

1.5 細胞凋亡檢測

將卵巢癌細胞系以4×104個/孔的密度接種到96孔板中培養，轉染后培養48 h，加入3 μg/mL DDP。依據凋亡試劑盒說明書進行操作，采用流式細胞術進行檢測。實驗重復3次。

1.6 免疫熒光定位

將圓形細胞爬片置于24孔細胞培養板內，每孔加入5 000個卵巢癌細胞系并分為CDDP組和空白組，每組細胞設3個復孔。以免疫熒光封閉液在常溫下封閉1 h，一抗4 ℃溫育過夜。復溫，二抗避光常溫溫育1 h；在載玻片上加1滴防淬滅封片劑，將上述圓形細胞爬片細胞面貼附于載玻片之上，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 CDDP作用于卵巢癌細胞對PAFR表達的影響

用不同濃度的CDDP作用于卵巢癌SKOV-3和CAOV-3細胞24 h，RTFQ-PCR及Western blot結果顯示，隨著CDDP處理濃度的增加，SKOV-3和CAOV-3細胞中PAFR的mRNA表達及蛋白水平升高并呈劑量依賴性（P＜0.01）。處理細胞的CDDP為最低劑量（2.5 μmol/L）時，PAFR RNA水平增加1.2倍；處理細胞的CDDP為最高劑量（60 μmol/L）時，PAFR RNA水平增加3.2倍。隨著CDDP處理劑量的增加，SKOV-3和CAOV-3細胞中PAFR蛋白表達水平分別升高3.4和4.0倍。此外，用相同濃度（10 μmol/L）的CDDP處理細胞不同時間，RTFQ-PCR及Western blot結果顯示，1 h后PAFR的RNA及蛋白表達水平均較空白對照組升高，并在處理24 h后表達量達到高峰（P＜0.01，圖1）。上述結果說明，CDDP能夠引起卵巢癌細胞中PAFR的表達升高，并且這種升高呈現劑量及時間依賴性。

圖1 CDDP能夠引起卵巢癌SKOV-3和CAOV-3細胞中PAFR表達升高Fig.1 CDDP induces increased PAFR expression in human ovarian cancer SKOV-3 and CAOV-3 cells

2.2 核因子κB（nuclear factor Kappa-B，NFκB）/p65及缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在CDDP引起卵巢癌細胞PAFR表達升高中的作用

有文獻［8-9］報道，CDDP能夠調節細胞內轉錄因子（如NF-κB/p65、HIF-1α等）的活性，而在一些腫瘤細胞中PAFR所發揮的作用也與轉錄因子NF-κB/p65及HIF-1α相關［10-11］。因此，為研究轉錄因子NF-κB/p65及HIF-1α是否參與卵巢癌細胞中CDDP調節PAFR表達的過程，首先觀察CDDP作用于SKOV-3和CAOV-3細胞后NF-κB/p65及HIF-1α的表達。用10 μmol/L CDDP處理細胞不同時間后，Western blot結果顯示，在細胞核蛋白中，隨著CDDP處理時間的延長，NF-κB/p65及HIF-1α的蛋白表達水平逐漸升高。在各組細胞總蛋白中，NF-κB/p65及HIF-1α的蛋白表達水平并無明顯改變（圖2A、2B）。免疫熒光定位結果顯示，CDDP組細胞中NF-κB/p65及HIF-1α的蛋白表達呈現明顯的核聚集（圖2C）。上述結果說明，CDDP作用于卵巢癌細胞后能夠增加細胞核中NF-κB/p65及HIF-1α的蛋白表達。

圖2 CDDP可引起卵巢癌細胞株中轉錄因子NF-κB/p65及HIF-1α的核聚集Fig.2 CDDP treatment enhances the nuclear localization of NF-κB/p65 and HIF-1α

此外，本研究采用小RNA干擾技術沉默NF-κB/p65及HIF-1α后給予10 μmol/L CDDP處理細胞株24 h。Western blot及RTFQ-PCR結果顯示，沉默NF-κB/p65及HIF-1α后，CDDP作用的卵巢癌細胞系中PAFR的RNA及蛋白表達水平均顯著降低。與HIF-1α-siRNA相比，沉默NF-κB能夠更加有效地抑制CDDP誘導的PAFR表達（圖3A～3D）。細胞凋亡實驗結果顯示，與CDDP組細胞相比，CDDP與NF-κB-siRNA或HIF-1αsiRNA聯合作用時，細胞凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3E、3F）。上述結果說明，在卵巢癌細胞中，CDDP通過轉錄因子NF-κB/p65及HIF-1α增加PAFR的表達。

圖3 CDDP通過轉錄因子NF-κB/p65及HIF-1α增加卵巢癌細胞株中PAFR的表達Fig.3 NF-κB/p65 and HIF-1α are involved in CDDP-induced PAFR expression in ovarian cancer cells

2.3 抑制PAFR對卵巢癌細胞CDDP敏感性的影響

為探索CDDP 作用于卵巢癌細胞時上調PAFR的作用，用100 μmol/L PAFR特異性小分子拮抗劑WEB2086預處理SKOV-3和CAOV-3細胞1 h后再給予10 μmol/L CDDP作用24 h。細胞活力實驗結果顯示，WEB2086+CDDP組細胞增殖能力與對照組相比明顯降低（P＜0.01）；在細胞培養基中加入PAF后卵巢癌細胞系活性增強，而PAF+CDDP+WEB2086組細胞增殖能力與PAF+CDDP組相比亦明顯降低（P＜0.01，圖4A）。細胞凋亡實驗結果顯示，與CDDP組相比，WEB2086+CDDP組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01，圖4B）。此外，通過小RNA干擾技術沉默PAFR。Western blot結果顯示，si-PAFR能夠有效地抑制卵巢癌細胞中PAFR蛋白的表達。細胞凋亡實驗顯示，CDDP+PAFR-siRNA組細胞的凋亡率與對照組相比明顯升高（P＜0.05）。這一結果亦在Western blot中進行驗證，CDDP+si-PAFR組細胞中的cleaved-PARP/caspase-3蛋白表達水平明顯升高。Cleaved-PARP/caspase-3作為細胞凋亡的標志蛋白［12］，cleaved-PARP、cleavedcaspase-3表達越高，細胞凋亡率越高（圖4C）。上述結果說明，無論是通過特異性小分子拮抗劑或RNA干擾抑制PAFR表達均能夠顯著地提高卵巢癌細胞對于CDDP的敏感性。

圖4 抑制PAFR表達能夠提高卵巢癌細胞株對CDDP敏感性Fig.4 PAFR suppression enhances the CDDP sensitivity of ovarian cancer cells

2.4 CDDP作用卵巢癌細胞后PAFR下游信號通路的激活

mTOR-PI3K-AKT及MAPK通路是細胞增殖及凋亡的兩個重要信號轉導通路［13］。多項研究［14-16］證實，在多種癌細胞中PAF/PAFR信號軸可以激活相關信號通路分子。本研究驗證了AKT及ERK是否位于受CDDP作用而激活的PAFR下游信號通路中。用相同濃度（10 μmol/L）的CDDP作用于卵巢癌細胞不同時間，Western blot結果顯示，在SKOV-3和CAOV-3細胞中，隨著CDDP處理時間的延長，phospho-P70S6K/AKT/ERK蛋白表達水平均有所升高。將PAF加入細胞培養基中，p-P70S6K、p-AKT和p-ERK蛋白表達水平與對照組相比均有明顯升高（圖5A、5C）。為驗證AKT及ERK信號蛋白的激活是否為PAFR依賴性，實驗用不同濃度的PAFR特異性拮抗劑WEB2086預處理SKOV-3和CAOV-3細胞1 h后再給予10 μmol/L CDDP和（或）100 nmol/L PAF處理，Western blot結果顯示，隨著PAFR特異性拮抗劑WEB2086濃度的升高，p-P70S6K、p-AKT和p-ERK蛋白表達水平逐漸降低（圖5B、5D）。上述結果說明，CDDP作用于卵巢癌細胞后，受激活的PAF/PAFR能夠激活下游的AKT及ERK信號通路分子。

圖5 CDDP通過PAFR激活下游的AKT及ERK信號通路分子Fig.5 AKT and ERK signaling pathways lies downstream of activated PAFR in CDDP-treated ovarian cancer cells

3 討論

化療是中晚期卵巢癌治療的主要方法。然而，化療耐藥是導致卵巢癌患者復發死亡的主要原因之一?；熕幬镆环矫嫱ㄟ^各種機制試圖殺死癌細胞，而另一方面，化療藥物又激活了癌細胞的自我保護機制，從而對抗藥物的作用。因此，腫瘤化療的開始也意味著化療耐藥的發生［17］。闡明化療藥物所激發的細胞自我防御機制，探索有效的靶蛋白是克服化療耐藥的有效途徑。

CDDP是卵巢癌化療的一線藥物。鉑類化合物的作用機制主要是引起DNA鏈交聯，破壞DNA分子結構，從而抑制DNA復制和轉錄，促進癌細胞的死亡［18］。本課題組在既往研究［6］中選擇攜帶熒光報告基因的SKOV-3-luciferase細胞構建裸鼠的腹腔卵巢癌種植模型進行體內研究，采用腹腔注射的方式給予CDDP和（或）銀杏內酯B，使用小動物活體成像的方法動態觀察上述藥物對裸鼠腹腔種植瘤生長的抑制作用，結果證實，銀杏內酯B具有體內抑制卵巢癌生長的作用。已有文獻［19］報道，銀杏內酯B能夠通過抑制氧化應激及NF-κB活性而減輕脂多糖引起的急性肺損傷。NF-κB通常在細胞質中通過與阻斷NF-κB核轉位的抑制蛋白IκB-α/β結合而處于失活狀態。在多種腫瘤細胞中，NF-κB被激活并參與多種損傷及炎癥反應［20］。多項體內、體外實驗［21-23］均證實，NF-κB及HIF-1α等分子途徑與CDDP耐藥相關，盡管其具體機制尚不明確。根據本課題組既往研究［6］結果，銀杏內酯B具有體內抑制卵巢癌生長的作用，并可以增強腫瘤細胞對CDDP的敏感性，提示NF-κB及HIF-1α可能參與CDDP在卵巢癌細胞中的作用過程并與PAFR的調節有關。

本研究進一步證明此結論并探索相關機制。當CDDP作用于SKOV-3和CAOV-3卵巢癌細胞系后，細胞核蛋白中轉錄因子NF-κB/p65及HIF-1α的表達量升高，進而PAFR的RNA和蛋白表達水平升高。當抑制PAFR表達時，卵巢癌細胞對CDDP的敏感性明顯增強，即抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，并將癌細胞阻滯在G0/G1期，說明當CDDP應用于卵巢癌細胞，發揮抗腫瘤效果的同時，也激起了細胞內的自我防御機制。CDDP作用于卵巢癌細胞后，PAFR的表達升高有可能是卵巢癌細胞化療藥物耐受的一種分子機制。

本課題組既往研究［6］結果已證實在卵巢癌細胞中，PAFR與EGFR通過一系列的細胞內分子信號轉導通路傳輸信號，并共同激活下游的信號通路分子，如P70S6K、4EBP1、AKT及ERK蛋白等，發揮協同作用共同促進卵巢癌的發展［24］。P70S6K、4EBP1及AKT是PI3K/AKT/mTOR信號轉導通路中重要的蛋白分子，ERK是MAPK信號轉導通路中重要的蛋白分子。而PI3K/AKT/mTOR和MAPK信號轉導通路均是細胞代謝和抗凋亡的重要轉導途徑，不僅與多種惡性腫瘤的發生、發展及預后有關，并且與多種一線化療藥物關系密切［25］。

本研究發現，用CDDP處理卵巢癌細胞后，PAFR表達上調，從而對抗CDDP的抗腫瘤效應。繼而進一步探索CDDP作用于卵巢癌細胞后，上調的PAFR下游信號轉導通路的變化。結果顯示，當用同一濃度的CDDP作用于SKOV-3和CAOV-3細胞不同時間時，P70S6K/AKT/ERK蛋白均被激活，即phospho-P70S6K/AKT/ERK表達水平升高。而當向CDDP處理的卵巢癌細胞培養液中添加PAF時，phospho-P70S6K/AKT/ERK蛋白的表達水平均較無PAF添加的細胞組有所上升，提示CDDP作用于卵巢癌細胞后，PAFR的表達上升，從而與PAF相結合，進一步激活下游的信號通路分子，進而在卵巢癌細胞CDDP耐藥中發揮作用。

綜上所述，當CDDP 作用于卵巢癌細胞后，通過轉錄因子NF-κB/p65及HIF-1α能夠上調PAFR的表達，抑制PAFR后可以增加卵巢癌細胞對CDDP的敏感性。此外，當CDDP作用于卵巢癌細胞后，上調的PAFR與細胞內的特異性配體PAF作用可以進一步促進下游信號通路分子P70S6K、AKT、ERK的激活從而發揮生物學效應。因此，PAFR可能成為卵巢癌靶向治療的新靶點，這有望為聯合輔助治療提供一個新方向。