30例胸腺樣分化甲狀腺癌的回顧性分析及其機(jī)制研究

張婷婷，王蘊(yùn)珺，渠 寧，孫團(tuán)起

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

胸腺樣分化甲狀腺癌（carcinoma showing thymus-like differentiation，CASTLE）是非常罕見的甲狀腺癌病理學(xué)類型，于1985年首次報(bào)道，2004年被WHO正式歸類為一種獨(dú)立的甲狀腺腫瘤類型［1］。CASTLE通常起病隱匿，多以頸部腫塊的形式被發(fā)現(xiàn)，大部分患者就診時(shí)均處于較晚期。該病的術(shù)前細(xì)胞學(xué)診斷存在一定困難，易與甲狀腺鱗癌、分化較差或低分化的甲狀腺癌甚至胸腺鱗癌混淆。由于CASTLE發(fā)病率較低，目前多為個(gè)案報(bào)道，罕見隊(duì)列研究報(bào)道，相關(guān)診療經(jīng)驗(yàn)及對(duì)該疾病的認(rèn)知仍不足。本研究回顧并分析復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的30例CASTLE患者的資料并進(jìn)行機(jī)制探索。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

回顧并分析2007年9月1日—2021年9月1日復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸外科收治的30例CASTLE患者，其中男性13例，女性17例。所有患者均接受手術(shù)治療，手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)石蠟包埋切片及免疫組織化學(xué)檢測(cè)后由臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師診斷。患者的臨床特征、術(shù)前檢查結(jié)果、治療方法、病理學(xué)檢查結(jié)果及預(yù)后情況等資料均納入分析。通過門診就診、電話隨訪等方式，隨訪患者預(yù)后情況至2021年9月1日，共失訪4人，隨訪時(shí)間3～132個(gè)月，平均60.6個(gè)月。

1.2 機(jī)制探索

對(duì)3對(duì)CASTLE患者的腫瘤及瘤旁石蠟包埋組織樣本抽提DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序分析。基因組DNA抽提使用德國Qiagen公司基因組DNA抽提試劑盒并按操作說明進(jìn)行基因組DNA抽提。由上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序，并進(jìn)行相關(guān)突變基因分析。

采用pLKO.1 TRC克隆載體（Addgene質(zhì)粒10878）構(gòu)建MSH2過表達(dá)質(zhì)粒（引物：5'端引物5'-ACTGGATCCCAGTGCACAGTT-3'；3'端引物5'-TTGGTACCTGATTGGCCA-AGGCAGT-3'）。在甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1中轉(zhuǎn)染MSH2過表達(dá)質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒作為對(duì)照，并進(jìn)行GFP流式細(xì)胞術(shù)熒光分選，提取基因組DNA進(jìn)行測(cè)序。確定MSH2是否插入相關(guān)序列，鑒定成功后將其命名為TPC1-MSH2mut（相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞命名TPC1-Ctrl）。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，采用transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，分析MSH2基因?qū)谞钕侔┥飳W(xué)行為的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)患者基本特征中分類變量使用χ2檢驗(yàn)，連續(xù)變量使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床基本情況

30例CASTLE患者的年齡為33～63歲，平均年齡為48.2歲。1例患者為臟器反位，1例為先天性子宮畸形。全部患者均接受手術(shù)治療，其中26例為初次治療，4例為外院術(shù)后復(fù)發(fā)或殘留再次手術(shù)治療（表1）。

表1 30例CASTLE患者的臨床及病理學(xué)資料Tab.1 Clinical and pathological data of 30 CASTLE patients

患者術(shù)前檢查主要包括影像學(xué)檢查［超聲及頸部增強(qiáng)計(jì)算機(jī)體層成像（computed tomography，CT）］和細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查，對(duì)于部分患者行正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層顯像（positron emission tomography and computed tomography，PET/CT）檢查。30例患者中，6例通過細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查明確提示CASTLE可能；10例細(xì)胞學(xué)診斷為低分化癌；另4例僅診斷為惡性，但具體類型無法明確；6例術(shù)前未行穿刺檢查；3例穿刺診斷為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC），其中2例病理學(xué)切片證實(shí)同時(shí)伴隨有PTC。影像學(xué)檢查可評(píng)估腫瘤位置，其中9例位于甲狀腺內(nèi)，21例位于甲狀腺下方。66.7%（20/30）的患者出現(xiàn)不同程度的外侵，包括周圍肌肉、喉返神經(jīng)、頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)靜脈等。僅23例接受根治性切除，7例患者因腫瘤侵犯頸總動(dòng)脈等無法完整切除腫瘤，故行姑息性切除。

病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，腫瘤直徑平均為3.7 cm，范圍1.2～10.0 cm。18例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，8例中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，2例側(cè)頸轉(zhuǎn)移，2例伴有PTC的患者中央?yún)^(qū)僅發(fā)現(xiàn)PTC轉(zhuǎn)移。免疫組織化學(xué)分析中，全部病例CD5呈陽性，29例CD117呈陽性，P63陽性率為94.4%（17/18），CK5/6陽性率為93.8%（15/16），AE1/AE3陽性率為100.0%（16/16），甲狀腺球蛋白及降鈣素均為陰性，僅1例患者TTF-1呈陽性（該患者在手術(shù)3年后發(fā)生肺轉(zhuǎn)移）。

4 例患者因個(gè)人原因未進(jìn)行術(shù)后輔助放療，2例接受術(shù)后輔助放療聯(lián)合順鉑化療，剩余24例接受單純術(shù)后放療。術(shù)后放療方案為術(shù)后第3～4周起接受外照射治療，照射范圍為甲狀腺區(qū)及雙側(cè)頸部淋巴結(jié)引流區(qū)域，劑量為60 Gy/30 Fx～66 Gy/33 Fx。所有患者術(shù)后口服左甲狀腺素片行內(nèi)分泌替代治療。

30例患者中，4例完成治療后便失訪。經(jīng)過平均60.6個(gè)月的隨訪后，2例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其中，1例在接受手術(shù)治療時(shí)，因腫瘤廣泛外侵至頸總動(dòng)脈等重要血管，故行姑息性切除，術(shù)后行66 Gy/33 Fx的放療。然后患者在治療后3年發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，故行TP方案［紫杉醇200 mg（第1天）+順鉑37 mg（第1～3天）］化療，6個(gè)周期后療效評(píng)價(jià)穩(wěn)定，經(jīng)44個(gè)月隨訪至本研究結(jié)束，患者目前疾病穩(wěn)定。另1例患者為治療后41個(gè)月時(shí)發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，隨后予以DCF方案［多西他賽120 mg（第1天）+順鉑30 mg（第1～3天）+5-FU 0.5 g（第1～3天）］化療，8個(gè)周期后療效評(píng)價(jià)穩(wěn)定，至末次隨訪時(shí)間已48個(gè)月。其余患者隨訪期間無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或疾病相關(guān)性死亡。

2.2 分子機(jī)制探索

本研究對(duì)3對(duì)CASTLE患者腫瘤及瘤旁石蠟組織樣本抽提DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，結(jié)果識(shí)別到MSH2、FBXW7及NOTCH1存在外顯子突變（表2），其中MSH2突變率最高，突變位點(diǎn)均可以在My Cancer Genome和COSMIC數(shù)據(jù)庫中得到確認(rèn)。用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證，兩種方法檢測(cè)的吻合度均為100%。MSH2、FBXW7及NOTCH1基因突變?cè)贑OSMIC數(shù)據(jù)庫中確認(rèn)在甲狀腺癌及胸腺腫瘤中均有發(fā)生，其中MSH2在甲狀腺腫瘤中的突變率為1.71%，在胸腺腫瘤中為0.36%。

表2 CASTLE腫瘤組織測(cè)序結(jié)果Tab.2 Sequencing results of CASTLE tumor tissue

為探究突變型MSH2對(duì)于甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，通過在TPC1細(xì)胞中分別導(dǎo)入過表達(dá)空載體Vector（對(duì)照組）、過表達(dá)野生型MSH2及突變型MSH2基因并對(duì)其蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)（圖1A）。隨后，對(duì)3株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的增殖情況使用CCK-8進(jìn)行檢測(cè)（圖1B）。結(jié)果顯示，過表達(dá)野生型MSH2能在一定程度上加快細(xì)胞增殖速度（P＜0.05），而過表達(dá)突變型MSH2之后，細(xì)胞增殖速度顯著增加（P＜0.000 1）。對(duì)3株細(xì)胞進(jìn)行transwell遷移實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)突變型MSH2后，TPC1細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)，與CASTLE后期易發(fā)生轉(zhuǎn)移的情況一致。

圖1 MSH2突變對(duì)甲狀腺癌生物學(xué)行為的影響Fig.1 Effect of MSH2 mutation on biological behavior of thyroid carcinoma

3 討論

CASTLE是一種罕見的甲狀腺惡性腫瘤，目前全球報(bào)道尚不足百例。CASTLE通常起病于中年，發(fā)病年齡平均為48.2歲，范圍33～63歲。據(jù)報(bào)道，女性發(fā)病率可能稍高于男性［2］。本研究中男性13例，女性17例，女性稍多于男性，但樣本量較小，未見明顯差異。目前認(rèn)為CASTLE可能來源于異位胸腺或鰓囊殘留組織［3］，因此腫瘤多位于甲狀腺下極，本研究的30例患者中21例（70%）腫瘤位于甲狀腺下極。

據(jù)研究［2，4-5］報(bào)道，CASTLE的惡性程度相對(duì)較低且預(yù)后良好。但因?yàn)槠鸩‰[匿，因此發(fā)現(xiàn)并就診時(shí)疾病多處于晚期。本研究的30例患者中，腫瘤直徑≥4 cm者11例，僅2例患者腫瘤直徑＜2 cm，腫瘤平均直徑為3.7 cm。另外，66.7%（20/30）的患者出現(xiàn)不同程度的外侵，包括周圍肌肉、喉返神經(jīng)、頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)靜脈等。其中有7例甚至因?yàn)閺V泛外侵頸總動(dòng)脈等重要血管而無法根治性切除。10例患者病理學(xué)檢查證實(shí)存在中央?yún)^(qū)或側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，2例患者在術(shù)后發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，提示CASTLE不僅具有局部外侵的特點(diǎn)，而且具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。

CASTLE術(shù)前檢查手段主要包括影像學(xué)檢查（頸部超聲、增強(qiáng)CT）和細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查等。然而其與甲狀腺鱗癌、低分化癌、胸腺癌及甲狀旁腺腫瘤的鑒別診斷較為困難。這幾種腫瘤均表現(xiàn)為甲狀腺區(qū)或甲狀腺下方占位性病變，影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性，細(xì)胞形態(tài)也難于區(qū)分。但是對(duì)于CASTLE術(shù)前診斷，細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查仍是十分重要的。CASTLE的細(xì)胞學(xué)特征包括：⑴細(xì)胞成分豐富；⑵細(xì)胞團(tuán)中無乳頭狀或?yàn)V泡狀細(xì)胞形態(tài)；⑶細(xì)胞呈圓形或紡錘形，邊界不清，核仁消失；⑷少量角化灶和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)腔（intracytoplasmic lumina，ICL）形成；⑸涂片背景內(nèi)見淋巴細(xì)胞［5］。本研究中，僅20%（6/30）的患者通過術(shù)前細(xì)胞學(xué)檢查診斷為CASTLE，10例細(xì)胞學(xué)診斷為低分化癌，因此對(duì)于細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查提示低分化癌的甲狀腺腫物需考慮其為CASTLE的可能性。免疫組織化學(xué)標(biāo)志物在CASTLE的病理學(xué)診斷中十分重要，CD5、CD117呈陽性能對(duì)其進(jìn)行有效的鑒別診斷［5-6］。本研究中CD5全部呈陽性，CD117僅1例呈陰性。另外，P63、CK5/6及AE1/AE3也表現(xiàn)出較強(qiáng)陽性，這與胸腺腫瘤免疫表型有重疊，可能與其發(fā)生來源有關(guān)。甲狀腺相關(guān)來源指標(biāo)甲狀腺球蛋白及降鈣素均為陰性，但有1例TTF-1呈陽性。本組研究中不同患者間的Ki-67增殖指數(shù)差異較大（范圍1%～70%），發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的2例患者Ki-67增殖指數(shù)分別為5%和12%，因此在CASTLE病例中，Ki-67增殖指數(shù)與腫瘤惡性生物學(xué)行為無明顯相關(guān)性。

本研究的30例患者中，7例未能行根治性手術(shù)。但經(jīng)過平均60.6個(gè)月的隨訪后，2例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，該2例患者接受補(bǔ)充化療后疾病穩(wěn)定，其余患者隨訪期間無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或疾病相關(guān)性死亡。手術(shù)是CASTLE的首選治療方式［7］。筆者認(rèn)為手術(shù)范圍應(yīng)至少包括患側(cè)甲狀腺腺葉+周圍受累組織器官+選擇性頸部淋巴結(jié)清掃。放療對(duì)CASTLE的治療價(jià)值雖未達(dá)成統(tǒng)一，但多數(shù)學(xué)者支持術(shù)后放療可能對(duì)減少復(fù)發(fā)有一定作用。據(jù)文獻(xiàn)［8］報(bào)道，CASTLE對(duì)放療較為敏感，同時(shí)接受手術(shù)及術(shù)后放療的患者局部復(fù)發(fā)率極低。化療在CASTLE中的地位尚不明確。2例發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的患者，1例接受TP方案后病灶明顯退縮，另1例接受DCF方案化療后病灶無明顯退縮，但目前疾病穩(wěn)定。

目前對(duì)CASTLE的發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子探究尚未見報(bào)道。本研究通過全基因檢測(cè)識(shí)別到MSH2、FBXW7及NOTCH1存在外顯子突變，其中MSH2突變率最高。MSH2突變常見于遺傳性非息肉性結(jié)腸癌，在甲狀腺癌中亦見報(bào)道［9-10］。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)突變型MSH2之后，TPC1細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)。因此，MSH2可能參與CASTLE的惡性生物學(xué)行為，是潛在的治療靶點(diǎn)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，CASTLE惡性程度低，進(jìn)展緩慢，預(yù)后良好。術(shù)前應(yīng)完善影像學(xué)檢查（頸部超聲、CT）和細(xì)胞學(xué)檢查，術(shù)后病理免疫組織化學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)尤其是CD5、CD117呈陽性對(duì)CASTLE的診斷十分重要。目前，根治性手術(shù)是CASTLE的首選治療方式，手術(shù)范圍應(yīng)至少包括患側(cè)甲狀腺腺葉切除術(shù)及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃，如有臨床可疑的頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則應(yīng)同時(shí)行同側(cè)的頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)清掃；術(shù)后放療可能對(duì)減少局部復(fù)發(fā)有一定作用。隨著對(duì)病例的總結(jié)及研究的深入，未來可以提高對(duì)CASTLE的認(rèn)知，為確立治療策略提供更好的幫助。