30例胸腺樣分化甲狀腺癌的回顧性分析及其機制研究

張婷婷，王蘊珺，渠 寧，孫團起

復旦大學附屬腫瘤醫院頭頸外科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

胸腺樣分化甲狀腺癌（carcinoma showing thymus-like differentiation，CASTLE）是非常罕見的甲狀腺癌病理學類型，于1985年首次報道，2004年被WHO正式歸類為一種獨立的甲狀腺腫瘤類型［1］。CASTLE通常起病隱匿，多以頸部腫塊的形式被發現，大部分患者就診時均處于較晚期。該病的術前細胞學診斷存在一定困難，易與甲狀腺鱗癌、分化較差或低分化的甲狀腺癌甚至胸腺鱗癌混淆。由于CASTLE發病率較低，目前多為個案報道，罕見隊列研究報道，相關診療經驗及對該疾病的認知仍不足。本研究回顧并分析復旦大學附屬腫瘤醫院收治的30例CASTLE患者的資料并進行機制探索。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

回顧并分析2007年9月1日—2021年9月1日復旦大學附屬腫瘤醫院頭頸外科收治的30例CASTLE患者，其中男性13例，女性17例。所有患者均接受手術治療，手術標本均經石蠟包埋切片及免疫組織化學檢測后由臨床經驗豐富的病理科醫師診斷。患者的臨床特征、術前檢查結果、治療方法、病理學檢查結果及預后情況等資料均納入分析。通過門診就診、電話隨訪等方式，隨訪患者預后情況至2021年9月1日，共失訪4人，隨訪時間3～132個月，平均60.6個月。

1.2 機制探索

對3對CASTLE患者的腫瘤及瘤旁石蠟包埋組織樣本抽提DNA進行全基因組測序分析。基因組DNA抽提使用德國Qiagen公司基因組DNA抽提試劑盒并按操作說明進行基因組DNA抽提。由上海伯豪生物技術有限公司進行全基因組測序，并進行相關突變基因分析。

采用pLKO.1 TRC克隆載體（Addgene質粒10878）構建MSH2過表達質粒（引物：5'端引物5'-ACTGGATCCCAGTGCACAGTT-3'；3'端引物5'-TTGGTACCTGATTGGCCA-AGGCAGT-3'）。在甲狀腺癌細胞株TPC-1中轉染MSH2過表達質粒及空載體質粒作為對照，并進行GFP流式細胞術熒光分選，提取基因組DNA進行測序。確定MSH2是否插入相關序列，鑒定成功后將其命名為TPC1-MSH2mut（相應對照細胞命名TPC1-Ctrl）。采用細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細胞增殖能力，采用transwell實驗檢測細胞侵襲能力，分析MSH2基因對甲狀腺癌生物學行為的影響。

1.3 統計學處理

使用SPSS 22.0軟件進行數據分析。對患者基本特征中分類變量使用χ2檢驗，連續變量使用t檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床基本情況

30例CASTLE患者的年齡為33～63歲，平均年齡為48.2歲。1例患者為臟器反位，1例為先天性子宮畸形。全部患者均接受手術治療，其中26例為初次治療，4例為外院術后復發或殘留再次手術治療（表1）。

表1 30例CASTLE患者的臨床及病理學資料Tab.1 Clinical and pathological data of 30 CASTLE patients

患者術前檢查主要包括影像學檢查［超聲及頸部增強計算機體層成像（computed tomography，CT）］和細針抽吸細胞學檢查，對于部分患者行正電子發射計算機體層顯像（positron emission tomography and computed tomography，PET/CT）檢查。30例患者中，6例通過細針抽吸細胞學檢查明確提示CASTLE可能；10例細胞學診斷為低分化癌；另4例僅診斷為惡性，但具體類型無法明確；6例術前未行穿刺檢查；3例穿刺診斷為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC），其中2例病理學切片證實同時伴隨有PTC。影像學檢查可評估腫瘤位置，其中9例位于甲狀腺內，21例位于甲狀腺下方。66.7%（20/30）的患者出現不同程度的外侵，包括周圍肌肉、喉返神經、頸總動脈及頸內靜脈等。僅23例接受根治性切除，7例患者因腫瘤侵犯頸總動脈等無法完整切除腫瘤，故行姑息性切除。

病理學檢查結果顯示，腫瘤直徑平均為3.7 cm，范圍1.2～10.0 cm。18例無淋巴結轉移，8例中央區淋巴結轉移，2例側頸轉移，2例伴有PTC的患者中央區僅發現PTC轉移。免疫組織化學分析中，全部病例CD5呈陽性，29例CD117呈陽性，P63陽性率為94.4%（17/18），CK5/6陽性率為93.8%（15/16），AE1/AE3陽性率為100.0%（16/16），甲狀腺球蛋白及降鈣素均為陰性，僅1例患者TTF-1呈陽性（該患者在手術3年后發生肺轉移）。

4 例患者因個人原因未進行術后輔助放療，2例接受術后輔助放療聯合順鉑化療，剩余24例接受單純術后放療。術后放療方案為術后第3～4周起接受外照射治療，照射范圍為甲狀腺區及雙側頸部淋巴結引流區域，劑量為60 Gy/30 Fx～66 Gy/33 Fx。所有患者術后口服左甲狀腺素片行內分泌替代治療。

30例患者中，4例完成治療后便失訪。經過平均60.6個月的隨訪后，2例發生遠處轉移。其中，1例在接受手術治療時，因腫瘤廣泛外侵至頸總動脈等重要血管，故行姑息性切除，術后行66 Gy/33 Fx的放療。然后患者在治療后3年發現肺轉移，故行TP方案［紫杉醇200 mg（第1天）+順鉑37 mg（第1～3天）］化療，6個周期后療效評價穩定，經44個月隨訪至本研究結束，患者目前疾病穩定。另1例患者為治療后41個月時發現肺轉移，隨后予以DCF方案［多西他賽120 mg（第1天）+順鉑30 mg（第1～3天）+5-FU 0.5 g（第1～3天）］化療，8個周期后療效評價穩定，至末次隨訪時間已48個月。其余患者隨訪期間無復發、轉移或疾病相關性死亡。

2.2 分子機制探索

本研究對3對CASTLE患者腫瘤及瘤旁石蠟組織樣本抽提DNA進行全基因組測序分析，結果識別到MSH2、FBXW7及NOTCH1存在外顯子突變（表2），其中MSH2突變率最高，突變位點均可以在My Cancer Genome和COSMIC數據庫中得到確認。用Sanger測序法驗證，兩種方法檢測的吻合度均為100%。MSH2、FBXW7及NOTCH1基因突變在COSMIC數據庫中確認在甲狀腺癌及胸腺腫瘤中均有發生，其中MSH2在甲狀腺腫瘤中的突變率為1.71%，在胸腺腫瘤中為0.36%。

表2 CASTLE腫瘤組織測序結果Tab.2 Sequencing results of CASTLE tumor tissue

為探究突變型MSH2對于甲狀腺癌細胞生物學行為的影響，通過在TPC1細胞中分別導入過表達空載體Vector（對照組）、過表達野生型MSH2及突變型MSH2基因并對其蛋白水平進行檢測（圖1A）。隨后，對3株穩定轉染株的增殖情況使用CCK-8進行檢測（圖1B）。結果顯示，過表達野生型MSH2能在一定程度上加快細胞增殖速度（P＜0.05），而過表達突變型MSH2之后，細胞增殖速度顯著增加（P＜0.000 1）。對3株細胞進行transwell遷移實驗，結果發現，過表達突變型MSH2后，TPC1細胞的遷移能力顯著增強，與CASTLE后期易發生轉移的情況一致。

圖1 MSH2突變對甲狀腺癌生物學行為的影響Fig.1 Effect of MSH2 mutation on biological behavior of thyroid carcinoma

3 討論

CASTLE是一種罕見的甲狀腺惡性腫瘤，目前全球報道尚不足百例。CASTLE通常起病于中年，發病年齡平均為48.2歲，范圍33～63歲。據報道，女性發病率可能稍高于男性［2］。本研究中男性13例，女性17例，女性稍多于男性，但樣本量較小，未見明顯差異。目前認為CASTLE可能來源于異位胸腺或鰓囊殘留組織［3］，因此腫瘤多位于甲狀腺下極，本研究的30例患者中21例（70%）腫瘤位于甲狀腺下極。

據研究［2，4-5］報道，CASTLE的惡性程度相對較低且預后良好。但因為起病隱匿，因此發現并就診時疾病多處于晚期。本研究的30例患者中，腫瘤直徑≥4 cm者11例，僅2例患者腫瘤直徑＜2 cm，腫瘤平均直徑為3.7 cm。另外，66.7%（20/30）的患者出現不同程度的外侵，包括周圍肌肉、喉返神經、頸總動脈及頸內靜脈等。其中有7例甚至因為廣泛外侵頸總動脈等重要血管而無法根治性切除。10例患者病理學檢查證實存在中央區或側頸區淋巴結轉移，2例患者在術后發生肺轉移，提示CASTLE不僅具有局部外侵的特點，而且具有淋巴結轉移及遠處轉移的特點。

CASTLE術前檢查手段主要包括影像學檢查（頸部超聲、增強CT）和細針抽吸細胞學檢查等。然而其與甲狀腺鱗癌、低分化癌、胸腺癌及甲狀旁腺腫瘤的鑒別診斷較為困難。這幾種腫瘤均表現為甲狀腺區或甲狀腺下方占位性病變，影像學表現缺乏特異性，細胞形態也難于區分。但是對于CASTLE術前診斷，細針抽吸細胞學檢查仍是十分重要的。CASTLE的細胞學特征包括：⑴細胞成分豐富；⑵細胞團中無乳頭狀或濾泡狀細胞形態；⑶細胞呈圓形或紡錘形，邊界不清，核仁消失；⑷少量角化灶和細胞質內腔（intracytoplasmic lumina，ICL）形成；⑸涂片背景內見淋巴細胞［5］。本研究中，僅20%（6/30）的患者通過術前細胞學檢查診斷為CASTLE，10例細胞學診斷為低分化癌，因此對于細針抽吸細胞學檢查提示低分化癌的甲狀腺腫物需考慮其為CASTLE的可能性。免疫組織化學標志物在CASTLE的病理學診斷中十分重要，CD5、CD117呈陽性能對其進行有效的鑒別診斷［5-6］。本研究中CD5全部呈陽性，CD117僅1例呈陰性。另外，P63、CK5/6及AE1/AE3也表現出較強陽性，這與胸腺腫瘤免疫表型有重疊，可能與其發生來源有關。甲狀腺相關來源指標甲狀腺球蛋白及降鈣素均為陰性，但有1例TTF-1呈陽性。本組研究中不同患者間的Ki-67增殖指數差異較大（范圍1%～70%），發生遠處轉移的2例患者Ki-67增殖指數分別為5%和12%，因此在CASTLE病例中，Ki-67增殖指數與腫瘤惡性生物學行為無明顯相關性。

本研究的30例患者中，7例未能行根治性手術。但經過平均60.6個月的隨訪后，2例發生遠處轉移，該2例患者接受補充化療后疾病穩定，其余患者隨訪期間無復發、轉移或疾病相關性死亡。手術是CASTLE的首選治療方式［7］。筆者認為手術范圍應至少包括患側甲狀腺腺葉+周圍受累組織器官+選擇性頸部淋巴結清掃。放療對CASTLE的治療價值雖未達成統一，但多數學者支持術后放療可能對減少復發有一定作用。據文獻［8］報道，CASTLE對放療較為敏感，同時接受手術及術后放療的患者局部復發率極低。化療在CASTLE中的地位尚不明確。2例發生肺轉移的患者，1例接受TP方案后病灶明顯退縮，另1例接受DCF方案化療后病灶無明顯退縮，但目前疾病穩定。

目前對CASTLE的發生、發展過程中的關鍵分子探究尚未見報道。本研究通過全基因檢測識別到MSH2、FBXW7及NOTCH1存在外顯子突變，其中MSH2突變率最高。MSH2突變常見于遺傳性非息肉性結腸癌，在甲狀腺癌中亦見報道［9-10］。通過細胞實驗證實，過表達突變型MSH2之后，TPC1細胞增殖及轉移能力顯著增強。因此，MSH2可能參與CASTLE的惡性生物學行為，是潛在的治療靶點，其具體機制有待進一步研究。

總之，CASTLE惡性程度低，進展緩慢，預后良好。術前應完善影像學檢查（頸部超聲、CT）和細胞學檢查，術后病理免疫組織化學標志物檢測尤其是CD5、CD117呈陽性對CASTLE的診斷十分重要。目前，根治性手術是CASTLE的首選治療方式，手術范圍應至少包括患側甲狀腺腺葉切除術及中央區淋巴結清掃，如有臨床可疑的頸側區淋巴結轉移則應同時行同側的頸側區淋巴結清掃；術后放療可能對減少局部復發有一定作用。隨著對病例的總結及研究的深入，未來可以提高對CASTLE的認知，為確立治療策略提供更好的幫助。