妊娠中期鼻骨發育異常胎兒的染色體檢測結果及相關因素分析

侯東霞，侯麗青，烏云塔娜，冀云鵬，王曉華，冀小平

利用超聲檢查篩選唐氏綜合征和其他染色體非整倍體是現行產前胎兒評估的重要內容，鼻骨發育異常是常見的超聲軟指標之一，包括胎兒鼻骨缺失和鼻骨發育不良。研究顯示，妊娠中期21-三體胎兒鼻骨缺失或發育不良發生率達50%以上，正常胎兒鼻骨缺失或發育不良發生率則較低[1-3]。2013年國際婦產科超聲協會（ISUOG）發布了《妊娠早期超聲檢查指南》[4]，其中指出應將鼻骨發育異常作為妊娠早期胎兒染色體非整倍體篩查的超聲指標。美國婦產科醫師學會（ACOG）在其2016年發布的胎兒染色體非整倍體篩查指南中也提出應將鼻骨缺失或發育不良作為胎兒染色體非整倍體篩查的有效超聲軟指標[5]，說明了鼻骨缺失或發育不良對胎兒染色體非整倍體篩查的重要性。隨著近幾年遺傳學技術的發展，染色體微陣列分析技術（CMA）已廣泛應用于產前診斷，因此在鼻骨發育異常的胎兒中也發現了一定比例的染色體微缺失微重復[6-8]。本研究回顧性分析了92例鼻骨缺失或發育不良胎兒的臨床資料和染色體檢查結果，旨在探討鼻骨發育異常與染色體數目異常和結構變異的相關性，為產前診斷提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年12月—2020年1月于內蒙古自治區婦幼保健院進行產前超聲檢查并提示胎兒鼻骨缺失或發育不良的92例孕婦及胎兒為研究對象。納入標準：單胎妊娠，定期產檢，超聲檢查提示胎兒鼻骨發育異常，并接受介入性產前診斷；排除標準：多胎妊娠，患有妊娠期糖尿病、高血壓等，病歷資料不全。

92例孕婦年齡21～43歲，平均年齡（30.3±4.5）歲；高齡孕婦（≥35歲）19例，平均年齡（37.3±2.1）歲；孕周17+5～27+3周；胎兒鼻骨缺失5例，鼻骨發育不良87例。

本研究價值：

本研究結合臨床實際情況，分析了胎兒鼻骨發育異常合并常見的產前高危因素在預測胎兒染色體異常中的價值，以及染色體微陣列分析技術（CMA）在胎兒鼻骨發育異常遺傳學檢測中的應用價值，發現鼻骨缺失或發育不良的胎兒染色體異常發生率較高，且與基因組變異有關；染色體核型分析、CMA結合其他產前篩查高危因素將有效提高染色體異常的檢出率。

根據胎兒系統超聲結果可將鼻骨發育異常分為孤立性鼻骨發育異常和非孤立性鼻骨發育異常。孤立性鼻骨發育異常指超聲僅提示鼻骨發育異常，未發現其他系統器官異常，本研究共84例（91.3%）。非孤立性鼻骨發育異常指超聲提示鼻骨發育異常合并其他超聲軟指標或器官系統異常，本研究共8例（8.7%），合并的異常包括室間隔缺損2例，脈絡叢囊腫2例，側腦室增寬、腎盂分離、十二指腸閉鎖、永久性右臍靜脈各1例。

其他產前檢查高危因素包括高齡產婦19例，胎兒頸項透明層（NT）增厚8例，血清學篩查（MSS）高風險6例，無創產前篩查（NIPT）高風險8例。

本研究經內蒙古自治區婦幼保健院倫理委員會批準（2018倫函審〔010〕號），且所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 羊水細胞采集與分離 按照無菌操作要求，經腹部行羊膜穿刺術抽取羊水30 ml，立即送往實驗室。以1 500 r/min離心10 min，離心半徑17 cm，收集羊水細胞。20 ml羊水離心后用于細胞培養及染色體核型分析；10 ml羊水離心后經Dulbecco磷酸鹽緩沖液（DPBS）清洗并用于CMA。

1.3 G顯帶核型分析 行常規羊水細胞培養及染色體制備，經收獲、制片、吉姆薩染色后，在光學顯微鏡下觀察并由細胞遺傳工作站獲得G顯帶染色體分裂象圖。計數20個分裂象，分析5個核型，嵌合型計數增加至50～100個分裂相。根據國際人類染色體命名系統（ISCN-2016）確定染色體核型。

1.4 CMA 使用Promega公司（美國）DNA提取試劑盒，按照說明書提取培養的羊水細胞基因組DNA。使用Thermo fisher公司（美國）CytoScanTM750K芯片，按照試劑盒說明書，將基因組DNA經酶切消化、接頭連接、PCR擴增、產物純化、片段化處理、標記、預雜交，之后將雜交液注入芯片，進行過夜雜交。次日，芯片經洗滌、染色和掃描獲得數據，采用ChAS軟件進行分析。通過在國際上常用的基因組與表型公共數據庫中比對查詢檢測到的基因組變異（CNV），包括正常人群基因組變異DGV數據庫（http://projects.tcag.ca/variationriatio），DECIPHER數據庫（https://decipher.sanger.ac.uk/），UCSC Genome Browser（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway），臨床基因組數據庫（ClinGene，http://www.clinicalgenome.org），在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，http://www.omim.org），同時在PubMed數據庫中檢索相關文獻，進行判讀。

1.5 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，計量資料以（±s）表示；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 染色體異常檢測結果 92例鼻骨發育異常胎兒中染色體核型分析檢出異常19例（20.6%），均為21-三體；CMA檢出異常25例（27.2%），其中19例為21-三體，6例為染色體微缺失微重復。

2.2 孤立性與非孤立性鼻骨發育異常胎兒染色體異常情況 孤立性與非孤立性鼻骨發育異常胎兒染色體異常發生率比較，差異無統計學意義（χ2=0.074，P=0.786，見表1）。

2.3 鼻骨發育異常合并其他產前篩查高危因素胎兒的染色體異常情況 與單純孤立性鼻骨發育異常胎兒相比，孤立性鼻骨發育異常+NT增厚、孤立性鼻骨發育異常+MSS高風險、孤立性鼻骨發育異常+NIPT高風險、孤立性鼻骨發育異常+2種及以上產前篩查高危因素胎兒染色體異常發生率均升高，差異有統計學 意 義（χ2=7.851，P=0.005；χ2=5.439，P=0.020；χ2=15.088，P＜0.001；χ2=18.528，P＜0.001）。 單 純孤立性鼻骨發育異常與孤立性鼻骨發育異常+高齡孕婦胎兒染色體異常發生率比較，差異無統計學意義（χ2=2.176，P=0.140）。

非孤立性鼻骨發育異常+NT增厚或高齡孕婦胎兒與單純非孤立性鼻骨發育異常胎兒比較，病例數太少，未進行統計學分析。

鼻骨發育異常合并其他產前篩查高危因素胎兒染色體異常情況詳見表2。

表1 孤立性與非孤立性鼻骨發育異常胎兒染色體異常發生率〔n（%）〕Table 1 Incidence of chromosomal abnormalities in second-trimester fetuses with isolated and non-isolated nasal bone abnormalities

表2 鼻骨發育異常合并其他產前篩查高危因素胎兒染色體異常情況〔n（%）〕Table 2 Incidence of chromosomal abnormalities in second-trimester fetuses with nasal bone abnormalities and with nasal bone abnormalities with other risk factors for chromosome abnormalities

2.4 染色體微缺失微重復分析及患者妊娠結局 6例染色體微缺失微重復病例的拷貝數變異情況、CNV致病性及妊娠結局見表3。病例3～5均正常分娩生產，截至2020年3月，嬰兒月齡為4個月～2周歲；跟蹤回訪嬰幼兒發育情況，根據家長描述，3名嬰幼兒的體格和智力發育情況均可達到其年齡段的正常水平。病例6仍在妊娠中，目前未發現胎兒其他發育異常。病例5和病例6發生相同位點的CNV。

3 討論

3.1 胎兒鼻骨缺失或發育不良的鑒別 在胎兒發育過程中，鼻骨約于孕6周時形成，9周時開始骨化，11周時即可在超聲檢查中觀察到其結構[2]。所謂鼻骨發育不良，是指胎兒鼻骨不同程度短小的超聲觀察結果。鼻骨缺失可以看作是鼻骨發育不良最嚴重的程度，相對容易識別。由于鼻骨發育不良與正常鼻骨長度之間的截斷值用作篩選指標的標準、定義相對困難，因此，歷史上發展了各種標準來定義鼻骨發育不良，如雙頂徑與鼻骨比例[9-10]，鼻骨長度低于正常同孕周胎兒的第5百分位、第 2.5百分位[11-12]，鼻骨長度 ＜2.5 mm[1]，鼻前組織厚度與鼻骨長度的比值[13-14]。鼻骨的長度通過超聲胎兒面部的正中矢狀面進行評估，理想情況下應能看到3條回聲線，上端線代表皮膚，下方較厚且回聲較上端皮膚強代表鼻骨，第三條線幾乎與皮膚相連但略高一點，則代表鼻尖[15]。正常發育的情況下，胎兒鼻骨長度隨著孕周增加呈線性增加[2-3]，并且隨種族和民族而異[16-17]。現在較多研究以鼻骨長度低于正常同孕周胎兒的第2.5百分位為標準判定鼻骨發育異常。本研究以妊娠中期鼻骨長度＜2.5 mm為鼻骨發育不良。

表3 6例染色體微缺失微重復患者CNV情況及妊娠結局Table 3 Copy number variations and pregnancy outcomes in 6 pregnant women with chromosomal microdeletions and microduplications

3.2 胎兒鼻骨發育異常與染色體異常的相關性 利用超聲標記篩查唐氏綜合征和其他染色體非整倍體是產前胎兒評估的重要內容。鼻骨是胎兒系統超聲顏面部檢查的一個重要軟指標。大量研究表明，鼻骨缺失或發育不良與胎兒染色體核型異常之間存在相關性，鼻骨發育異常的胎兒染色體異常發生率為21.7%～51.7%[7-8，18]，其中21-三體最常見。本研究在92例鼻骨發育異常胎兒中檢出的19例非整倍體染色體異常均為21-三體。多篇文獻報道在常規妊娠中期超聲檢查中有33%～100%的唐氏綜合征胎兒為鼻骨缺失或發育不良，在染色體正常胎兒中則為 0.39%～1.80%[1-3，19-20]，說明鼻骨發育異常與21-三體有較高的相關性。GEIPEL等[18]研究結果顯示，在頸褶厚度、鼻骨發育不良、靜脈導管回流及右房室瓣返流4個超聲指標中鼻骨發育不良對鑒別21-三體胎兒最為敏感。ALLDRED等[21]總結了早期妊娠超聲篩查唐氏綜合征的11個超聲指標，其中鼻骨缺失為預測唐氏綜合征胎兒特異度最高的指標，且50%的唐氏妊娠中可發現這一特征，說明相比于其他常見的染色體超聲軟指標，鼻骨發育異常與21-三體相關性更高。除21-三體外，鼻骨發育異常胎兒中常見的染色體非整倍體還有18-三體、13-三體和性染色體異常[7-8，18，22]。胎兒鼻骨發育異常已成為產前染色體非整倍體篩查的一個重要臨床指征。ISUOG和ACOG分別在2013年和2016年發布的產前篩查指南中指出了鼻骨缺失或發育不良對胎兒染色體非整倍體篩查的重要性[4-5]。此外，其他類型染色體異常，如三倍體和微缺失微重復，也在以鼻骨發育異常為產前診斷指征的胎兒中被發現[18，22]。

本研究比較了妊娠中期超聲提示孤立性鼻骨發育異常與非孤立性鼻骨發育異常胎兒的染色體異常發生率，結果未發現差異，但在多篇文獻中顯示，鼻骨缺失或發育不良合并其他妊娠中期超聲軟指標異常時對21-三體及其他染色體異常的預測率遠高于孤立性鼻骨發育異常[8，18，22]。本研究結果與上述文獻不符，可能原因是非孤立性鼻骨發育異常樣本數量較少。根據納入本研究病例的產前診斷指征，筆者進一步分析了孤立性與非孤立性鼻骨發育異常合并其他產前篩查高危因素胎兒染色體異常發生率，結果顯示，孤立性鼻骨發育異常合并NT增厚、MMS高風險、NIPT高風險時染色體異常發生率均顯著上升；合并2種及以上產前篩查因素時染色體異常發生率可達100.0%。由此可見，孤立性鼻骨發育異常合并其他產前篩查高危因素時多提示預后不良。有文獻指出，鼻骨發育異常和MSS高風險因素結合提高了染色體非整倍體篩選試驗的性能[22]。HAS等[19]報道將鼻骨發育評估和NT風險評估聯合時21-三體的檢出率雖沒有改變，但假陽性率下降，說明鼻骨發育異常合并其他產前篩查高危因素時其與染色體異常的相關性極大提升。本研究結果顯示當鼻骨發育異常合并其他產前篩查高危因素時染色體異常為21-三體，微缺失微重復均出現在單純的超聲異常病例中，提示超聲異常但核型正常的病例應當行CMA。

3.3 胎兒鼻骨發育異常與染色體微缺失微重復 本研究采用CMA在染色體核型正常的胎兒中又發現了6例微缺失微重復，較染色體核型分析多檢出6.5%（6/92）的染色體異常。歐陽魯平等[23]進行的一項針對241例鼻骨發育異常胎兒的研究顯示，SNP-array較染色體核型分析多檢出5.4%的染色體異常。在應用CMA檢測胎兒鼻骨發育異常的臨床研究中，常檢出染色體的微缺失微重復[24-25]。致病性CNV在鼻骨發育異常胎兒中的發現說明二者間存在潛在的相關性，但是目前的研究還未顯示這種相關性具體與哪些CNV聯系更密切。

本研究2例可能致病性CNV病例中1例為17q24.1q24.2缺失3.6 Mb，位于該片段內的缺失性CNV病例已被報道與多種畸形、生長發育遲緩和智力障礙等有關[26-27]，說明這一CNV表型譜較廣，鼻骨的發育可能受到其影響；另1例為X染色體上DMD基因部分重復，目前沒有證據顯示DMD基因與鼻骨發育有直接關系，且DMD基因異常導致的表型是相對特異的，鼻骨發育異常的胎兒中也可能檢測到并不相關的CNV變異，這種情況在臨床中時有遇到。本研究4例臨床意義不明的CNV病例中有2例同為15q11.2重復518 kb，這一變異在DGV和DECIPHER數據庫中有較多記錄。15q11.2重復在人群中外顯率不同，攜帶此變異者有的表現為正常，也有的表現為發育遲緩、智力障礙和多發畸形等，且親代與子代間表現也可能不同[28-29]。基于這一變異的表型多樣性，推測其與鼻骨發育異常之間可能存在關聯。此類在人群中外顯率差異性較大的CNV，在產前病例中應報告為臨床意義不明，在產后病例中可根據患者表型進行報告。

綜上所述，胎兒鼻骨缺失或發育不良是產前診斷的重要指征，孤立性或非孤立性鼻骨發育異常均與染色體異常有較高的相關性，且染色體異常類型包括染色體非整倍體與微缺失微重復。妊娠中期鼻骨發育異常合并其他產前篩查高危險因素時染色體異常發生率升高，多提示預后不良。CMA應用于鼻骨發育異常胎兒的染色體檢測，可檢出染色體核型分析不能發現的致病性CNV，使染色體異常檢出率提高，但同時也面臨著一些CNV致病性不明確的挑戰。總體來說，常規染色體核型分析結合CMA應用于產前診斷，可為鼻骨發育異常胎兒的遺傳咨詢、預后評估和臨床決策提供更全面的遺傳學信息，建議在臨床中推廣應用。

作者貢獻：侯東霞進行文章的構思與設計，統計學處理，撰寫論文；侯東霞、冀云鵬進行研究的實施與可行性分析；侯東霞、侯麗青進行結果的分析與解釋；侯麗青進行數據整理；烏云塔娜進行數據收集；冀云鵬、冀小平進行論文的修訂；王曉華負責文章的質量控制及審校；王曉華、冀小平對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。