解毒生肌膏對糖尿病潰瘍大鼠創面局部IL-6、TNF-α表達的影響?

黃潔雅，陳 麗，周忠志，戴飛躍，張 揚，陳敏敏，劉 慧，姜佳呈，廖亮英△

(1.湖南中醫藥大學，長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410007)

皮膚潰瘍是糖尿病常見并發癥之一，嚴重影響患者生活質量甚至危及生命[1]。大量研究表明，糖尿病皮膚潰瘍的發病機制復雜，多種因素均可導致發病[2]，其中炎癥反應為主要因素，白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)為反應主要因子[3，4]。解毒生肌膏由全蝎、蜈蚣、乳香、沒藥4味中藥按君臣佐使原則精密配伍制成，在臨床治療糖尿病皮膚潰瘍數年，獲得了較好的臨床療效。本課題組在前期臨床應用基礎上，構建糖尿病大鼠全層背部皮膚缺損模型，擬通過肉眼觀察創面愈合情況，蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察組織形態學改變，免疫組化法分析IL-6、TNF-α陽性表達量變化等技術對該藥促進潰瘍愈合的機制進行研究。本研究由湖南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會審核通過，批準編號LL2019112001。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠45只，4～6周齡，體質量180～220 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證SCXK(湘)2016-0002，統一飼養于湖南中醫藥大學動物房。清潔并消毒動物房及鼠籠；雄性SD大鼠分籠飼養，每籠大鼠5只共9籠；飼養環境為清潔級，濕度保持在45%～75%，室溫控制在20～25 ℃。大鼠標準飼料和飲用礦物質水飼養，自由飲食飲水，每天補充1次飼料和水，更換1次墊料并消毒籠具，光暗周期12 h。

1.2 藥物

解毒生肌膏藥物組成：全蝎、蜈蚣、乳香、沒藥4味中藥，湖南中醫藥大學第一附屬醫院(專利申請號JSI01039ZYFS)；磺胺嘧啶銀乳膏，新鄉市華信藥業有限公司(批號H20094208)；鏈脲佐菌素(STZ)，sigma-aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司(貨號S0130)；檸檬酸鈉緩沖液，北京索萊寶科技有限公司(貨號C1013)；6-正丙基-2-硫代尿嘧啶，上海源葉生物科技有限公司(貨號S30643)；膽酸鈉(豬)，上海源葉生物科技有限公司(貨號S30219)；吐溫-80，天津市科密歐化學試劑有限公司(批號20130128)；1,2-丙二醇，湖南匯虹試劑有限公司(批號20160412)；Anti-IL-6 抗體，Abcam公司艾博抗(上海)貿易有限公司(貨號ab9324)；Anti-TNF Receptor II antibody[EPR1653]，Abcam公司艾博抗(上海)貿易有限公司(貨號ab109322)。

1.3 試劑

1.3.1 高脂乳劑的配制 將100 g食用豬油放到水浴鍋上加熱，以澄清油樣透明為準。取50 g膽固醇分多次加入研缽，研磨至無亮光后將其加入，并充分攪拌混勻于100 g豬油中，然后依次攪拌加入1 g丙硫氧嘧啶、10 g膽酸鈉、已預熱的100 mL吐溫-80和100 mL丙二醇，最后緩慢加入適量蒸餾水定容至500 mL并搖晃均勻。

1.3.2 鏈脲佐菌素溶液的配制 分別取出100 mg冷凍保存的鏈脲佐菌素粉末(STZ)和5 mL冷藏保存的檸檬酸鈉緩沖液，將STZ溶解于檸檬酸鈉緩沖液中，配制濃度為20 mg/mL的STZ溶液，避光操作，30 min內配制并使用。

1.3.3 分組藥物制備 適應性喂養雄性SD大鼠3 d后，將45只大鼠按隨機數字表法分成模型組、解毒生肌膏組和磺胺嘧啶銀乳膏組各15只。3組大鼠均分別隨機分為3個時間點：即3 d、7d、21 d，每個時間點5只大鼠。藥物制備方法按一定比例混合磨碎加工佐以凡士林調和制成，試驗全過程使用同種劑量藥物。

1.3.4 糖尿病大鼠創面模型制備[5，6]每天同一時間段以2 ml/只的劑量，連續灌胃各組雄性SD大鼠高脂乳劑2周。各組雄性SD大鼠禁食不禁水，24 h之后按照40 mg/kg劑量腹腔注射配制濃度為20 mg/mL的STZ溶液。72 h后將各組雄性SD大鼠剪尾取血，測定隨機血糖水平超過16.7 mmoL/L則為2型糖尿病大鼠模型造模成功。按照3.5 mL/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉各組2型糖尿病大鼠并備皮，在大鼠已脫毛的背部脊柱兩側標記2個對稱直徑為1.5 cm的圓形圖案，常規消毒后且沿標記線用手術刀創設2個全層皮膚缺損區域，創面深達筋膜層，即成功建立2型糖尿病大鼠皮膚創面模型。

1.3.5 給藥 造模成功后，模型組不做處理，解毒生肌膏組大鼠創面上立即均勻被覆一層解毒生肌膏，磺胺嘧啶銀乳膏組的大鼠創面上立即均勻被覆一層磺胺嘧啶銀乳膏，并每天進行換藥。

1.3.6 血糖測量 (1)剪尾法：調試、校對血糖儀插入匹配試紙，消毒后于大鼠尾尖剪除約0.3 cm，并從尾根部向尾尖捋擠，流出第一滴血棄去不用，第二滴血吸于血糖儀試紙吸血點，按壓大鼠尾部止血，讀取血糖結果并記錄；(2)測量時間：分別于適應性喂養第3天、高脂乳劑喂養第14天后(STZ注射禁食前)、STZ注射第72 h后、糖尿病大鼠造模成功后每3 d以及取材當天同一時間段進行隨機血糖測量。

1.3.7 標本采集 分別于造模后3 d、7d、21 d為模型組、解毒生肌膏組和磺胺嘧啶銀乳膏組對每個時間點的大鼠進行取材。首先將大鼠麻醉觀察創面愈合情況并拍照記錄，冰上以創面為中心取大小為2 cm×2 cm的標本，于4%多聚甲醛溶液的瓶中固定，常溫保存。取材結束后采用頸椎脫臼處死法處死大鼠。

1.3.8 觀察指標 (1)創面大體形態學：肉眼觀察3組大鼠3 d、7d、21 d時間點；(2)HE染色：10%福爾馬林緩沖液浸泡標本一晚后石蠟包埋，制作組織切片(5 μm)進行HE染色做形態學評估；(3)免疫組化法：取皮膚創面標本組織脫蠟至水，抗原修復、孵育，滴加一抗(IL-6濃度0.125 μg/ml，TNF-α稀釋濃度1/100-1/250)、反應增強液、增強酶標記的山羊抗小鼠/兔IgG H&L，顯色、蘇木精復染、脫水、透明和封片，測定3組3個時間點皮膚創面中IL-6、TNF-α受體陽性表達量(通過Image J軟件計算得到)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠血糖結果

圖1示，在適應性喂養階段，各組大鼠的隨機血糖值均在5.5～7.8 mmol/L區間內，屬正常范圍。在高脂乳劑灌胃后即注射STZ禁食前，血糖值未見明顯變化。注射STZ后72 h隨機血糖值升高明顯，各大鼠血糖值均高于16.7 mmol/L，一部分大鼠血糖值升高尤為顯著，甚至高于血糖儀測量上限。在造模成功后直到取材前這段時間內，大鼠血糖值有輕微波動且略微下降，但大鼠一直保持著高血糖狀態。

圖1 實驗全過程血糖變化比較

2.2 創面愈合情況

2.2.1 各組各時間點大鼠創面大體形態學結果 圖2示，取材前將各時間點大鼠麻醉后對創面進行局部拍照記錄，拍照并制作各組大鼠潰瘍創面大體形態學示意圖。造模后3 d模型組創緣腫脹不明顯，創面有少量膿點并有較多分泌物，可見新生肉芽組織(圖2-A)；解毒生肌膏組造模后3 d創緣腫脹明顯，創口面積縮小，創面分泌物較少，可見新生肉芽組織(圖2-D)；磺胺嘧啶銀乳膏組腫脹較輕，創面有較多干燥的膿性分泌物(圖2-G)。造模后7 d模型組創緣腫脹減輕，創面無明顯膿性分泌物，可見較厚痂皮(圖2-B)；解毒生肌膏組腫脹明顯減輕，創面無膿性分泌物，可見較厚且干燥的痂皮，創口面積明顯縮小(圖2-E)；磺胺嘧啶銀乳膏組腫脹略減輕，可見較干燥且薄的痂皮，創口面積縮小較明顯(圖2-H)。造模后21 d模型組部分痂皮脫落，創口面積小，創面呈愈合趨勢(圖2-C)；解毒生肌膏組痂皮脫落，創面基本完全愈合(圖2-F)；磺胺嘧啶銀乳膏組創面有干燥痂皮覆蓋，創口面積較小，創面基本愈合(圖2-I)。

注：A.3 d模型組；B.7 d模型組；C.21 d模型組；D.3 d解毒生肌膏組；E.7 d 解毒生肌膏組；F.21 d解毒生肌膏組；G.3 d磺胺嘧啶銀乳膏組；H.7 d磺胺嘧啶銀乳膏組；I.21 d磺胺嘧啶銀乳膏組圖2 3、7、21 d時間點各組大鼠潰瘍創面大體形態學示意圖

2.2.2 各組各時間點大鼠創面HE染色結果 造模后3 d模型組創緣表皮層次多且分布不均勻，創面結構紊亂(圖3-1A)，膠原纖維、肌細胞水腫明顯(圖3-1B1C)；解毒生肌膏組創緣結構完整均一(圖3-1D)，創面成纖維細胞和毛細血管增生明顯，細胞種類多，肉芽組織豐富(圖3-1E1F)；磺胺嘧啶銀乳膏組創緣結構較完整(圖3-1G1H1I)。造模后7 d模型組創緣新生表皮較厚，層次不清，結構紊亂(圖3-2A)，炎癥細胞浸潤明顯(圖3-2B)，創面可見大量毛細血管，肉芽組織豐富(圖3-2C)；解毒生肌膏組創緣平整且薄，層次均勻清楚(圖3-2D)，可見豐富細膩而平行排列的膠原纖維，成纖維細胞多且呈長梭形(圖3-2E)，肉芽組織和毛細血管明顯(圖3-2F)；磺胺嘧啶銀乳膏組創緣平整較薄，層次分明(圖3-2G)，肉芽組織和毛細血管較多(圖3-2H)，可見較多的膠原纖維、成纖維細胞(圖3-2I)。造模后21 d模型組創緣見少量新生毛囊(圖3-3A3B)，創面成纖維細胞數量多，膠原纖維明顯增多但排列紊亂(圖3-3C)；解毒生肌膏組創緣表皮基本愈合，結構、層次清楚(圖3-3D)，可見較多成熟的新生毛囊和皮脂腺等附屬器(圖3-3E)，創面膠原豐富，成纖維細胞退化(圖3-3F)；磺胺嘧啶銀乳膏組創緣表皮愈合(圖3-3G)，成纖維細胞減少，膠原纖維粗(圖3-3H),附屬器發育不成熟(圖5-I)。

注：1～3分別為造模后3 d 3組創面HE染色圖片、造模后7 d 3組創面HE染色圖片、造模后21 d 3組創面HE染色圖片；A-C.模型組(A為×20，B為紅框內結構×200，C為藍框內結構×200)；D-F.解毒生肌膏組(D為×20，E為紅框內結構×200，F為藍框內結構×200)；G-I.陽性對照組(G為×20，H為紅框內結構×200，I為藍框內結構×200)圖3 3、7、21d時間點各組大鼠潰瘍創面HE染色示意圖

2.3 各組各時間點創面 IL-6、TNF-α免疫組化結果

IL-6、TNF-α陽性表達部位為巨噬細胞分泌物中，表達為棕黃色顆粒。圖4、5及表1、2示，造模后3 d對比模型組和磺胺嘧啶銀乳膏組，解毒生肌膏組炎癥細胞陽性表達明顯增多(P<0.05)；造模后7 d與模型組和磺胺嘧啶銀乳膏組比較，解毒生肌膏組棕黃色表達顆粒減少，炎癥細胞數量驟減，陽性表達量明顯降低(P<0.05)；造模后21 d，除解毒生肌膏組較模型組IL-6表達數量明顯降低外(P<0.05)，其余組別比較差異無統計學意義(P>0.05)，較模型組和磺胺嘧啶銀乳膏組比較，解毒生肌膏組IL-6、TNF-α表達量提前達到峰值，且表達量峰值低于模型組和磺胺嘧啶銀乳膏組峰值。

表1 3、7、21 d時間點各組大鼠潰瘍創面 IL-6陽性表達量

注：從上至下依次為3、7、21 d時間點TNF-α表達示意圖(免疫組化染色×100)；A-C.3 d時間點(A為模型組，B為解毒生肌膏組，C為磺胺嘧啶銀乳膏組)；D-F.7 d時間點(D為模型組，E為解毒生肌膏組，F為磺胺嘧啶銀乳膏組)；G-I.21 d時間點(G為模型組，H為解毒生肌膏組，I為磺胺嘧啶銀乳膏組)圖5 3、7、21 d時間點各組大鼠潰瘍創面TNF-α表達示意圖(免疫組化染色 ×100)

3 討論

糖尿病潰瘍的發病機制尚不完全清楚，大量研究認為主要是由于體內高糖環境、氧化應激以及炎癥反應等多種生物因素共同導致[7-9]，而炎癥反應是其主要機制[10]。炎癥反應是指致炎因子作用于機體后，引發組織細胞的損壞，使局部組織細胞顯現變性、壞死的現象，同時誘發組織細胞產生抗炎反應維持局部平衡。而TNF-α、IL-6等為炎癥反應中的主要炎癥因子，是反應炎癥水平的重要指標[11]。

表2 3、7、21d時間點各組大鼠潰瘍創面TNF-α陽性表達量

創面愈合即皮膚在損傷后通過體內各種因子相互作用進行修復，是一種機體自我動員，主要包括凝血期、炎癥期、增殖期、塑形期[17，18]，各期出現異常均可導致創面難愈。在持續高糖環境下，體內晚期糖基化終末產物(advanced glyclation end-products，AGEs)異常蓄積，與相應受體結合后觸發炎癥細胞產生IL-6、TNF-α等炎癥因子，誘發炎癥反應。大量研究發現，炎癥反應可以引發氧化應激，如王文珊[12]證實炎癥介質會刺激細胞，使之產生大量ROS，從而引起氧化應激。此外，炎癥反應會引起局部微循環通透性增加，使微血管擴張，導致體液滲出和組織水腫；而大量炎癥細胞瘀積會導致微循環局部栓塞，造成組織缺血壞死，使創面難以愈合[12-14]。綜上所述，AGEs與其受體結合后，引發炎癥、氧化應激、微循環障礙等一系列相互級聯反應，其中炎癥反應是導致糖尿病皮膚潰瘍創面難愈的重要因素[15，16]。因此猜想，降低創面修復過程中炎癥因子表達，以減輕炎癥期反應、促進創面愈合是治療糖尿病潰瘍的關鍵。

解毒生肌膏是由全蝎、蜈蚣、乳香、沒藥按君臣佐使原則精密配伍制成，是本課題組指導老師經過長期臨床實踐研究總結的全新經驗方。現代藥理學研究表明，全蝎具有抗血栓形成、抑菌[19]、收縮血管[20]的作用，蜈蚣酸性水提液可以阻止真菌生長繁殖，乳香化合物136具有抗炎作用[21]，沒藥水煎劑(1∶2)中所含的丁香油酚可能有抗真菌作用，其他的一些活性成分對急慢性炎癥都有抑制作用[22]。由此推斷，解毒生肌膏具有抑制炎癥反應、抗氧化、抗微血栓形成等藥理作用[23-25]。

肉眼觀察結果顯示，解毒生肌膏組創面愈合速度明顯加快，愈合面瘢痕較少。HE染色示，解毒生肌膏組表皮、真皮層水腫明顯減輕，表皮結構層次清晰，成纖維細胞、膠原更豐富，新生毛囊等附屬器增殖旺盛。免疫組化結果發現，在每個愈合時期，解毒生肌膏組和磺胺嘧啶銀乳膏組與模型組比較，IL-6和TNF-α表達量均顯著降低，其中解毒生肌膏組降低程度更大(P<0.05)，且解毒生肌膏組于造模后3 d其炎性細胞表達量提前達到峰值。研究結果證實，解毒生肌膏可降低炎癥因子表達，加速潰瘍愈合。

綜上研究結果證實，中藥解毒生肌膏可通過下調IL-6、TNF-α的表達減輕炎癥，同時促進糖尿病創面愈合，提高愈合質量，但其具體機制仍需進一步深入研究。