外敷復(fù)方五鳳草液對(duì)結(jié)核性潰瘍患者創(chuàng)面愈合影響及作用機(jī)制研究?

薛倩一，黃子慧，錢佳燕，洪練青

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南京 210014)

結(jié)核性潰瘍是結(jié)核分枝桿菌侵犯機(jī)體局部組織，造成受侵或鄰近皮膚及皮下軟組織慢性壞死，最終導(dǎo)致皮膚破潰甚至形成竇道的一種臨床常見的慢性難愈性創(chuàng)面疾病。其病程纏綿，創(chuàng)面不易愈合，或易形成假性愈合等，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量[1]。臨床對(duì)于本病主要以基礎(chǔ)抗結(jié)核治療為主，但由于結(jié)核性潰瘍創(chuàng)面周圍血供破壞嚴(yán)重，全身性抗結(jié)核藥在創(chuàng)面組織中難以達(dá)到有效殺菌濃度，導(dǎo)致局部療效較差[2]，故而在結(jié)核性潰瘍的治療過(guò)程中，局部外治藥物尤顯重要。但目前臨床上針對(duì)能顯著促進(jìn)結(jié)核性創(chuàng)面愈合且作用機(jī)制明確的外用藥物研究較少，因此，尋找可納入治療結(jié)核性潰瘍的藥物是目前臨床亟需解決的問(wèn)題。

復(fù)方五鳳草液由白及、貓爪草、澤漆(又名五鳳草)組成，是南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院瘰疬科研發(fā)的治療結(jié)核性潰瘍的經(jīng)典名方，已在多年的臨床和實(shí)驗(yàn)中取得了顯著療效[3，4]，但其臨床作用機(jī)制仍不明確。有文獻(xiàn)報(bào)道[5]，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在結(jié)核性潰瘍患者血漿及肉芽組織中有高表達(dá)，TNF-α又激活下游炎癥反應(yīng)信號(hào)通路IL-1、IL-6、NF-κB等蛋白表達(dá)，使得創(chuàng)面呈現(xiàn)持續(xù)慢性炎癥狀態(tài)；同時(shí)，結(jié)核性潰瘍患者血漿及肉芽組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)含量降低，肉芽組織和微小新生毛細(xì)血管的形成減慢，患者創(chuàng)面的愈合延遲。

因此，本文通過(guò)觀察患者創(chuàng)面愈合情況，檢測(cè)患者血漿及創(chuàng)面肉芽組織中TNF-α、TGF-β相關(guān)通路蛋白和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)變化，對(duì)比鏡下肉芽組織病理學(xué)改變，綜合闡述復(fù)方五鳳草液對(duì)結(jié)核性潰瘍創(chuàng)面的愈合影響及其作用機(jī)制。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，批件號(hào)201901001，所有患者接受給藥前均簽署知情同意書。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年12月至2019年12月南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院瘰疬科收治入院的結(jié)核性潰瘍患者為研究對(duì)象，且符合納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)按照《現(xiàn)代結(jié)核病學(xué)》[8]和《常見疾病的診斷與療效判定(標(biāo)準(zhǔn))》制定[9]：膿腫破潰后膿液稀薄夾有敗絮樣物，瘡口潛行，久不愈合，病理證實(shí)為結(jié)核，或膿液涂片找到抗酸結(jié)核桿菌，可有肺結(jié)核病史或肺結(jié)核接觸史，伴有低熱盜汗、神疲乏力、消瘦等全身癥狀。

中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中醫(yī)外科學(xué)》第3版[23]瘰疬病辨證分型制定標(biāo)準(zhǔn)：選擇氣血兩虛證患者，如局部創(chuàng)面膿水淋漓、肉色不鮮，肉芽組織顏色蒼白，腐肉不脫，極難收口，形成空腔或竇道，經(jīng)久不愈。患者神疲乏力，面色蒼白，氣短懶言，語(yǔ)聲低微，常自汗，頭暈?zāi)垦＃募拢噘|(zhì)淡，苔薄白，脈細(xì)弱。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合診斷標(biāo)準(zhǔn)(西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)以及中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)中的氣血兩虛證)；年齡 18～65歲；患者自愿接受本實(shí)驗(yàn)并簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

合并有心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病、精神病患者、腫瘤或艾滋病患者；合并嚴(yán)重感染且病情危重患者;神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)障礙者;妊娠或哺乳期婦女、過(guò)敏體質(zhì)者;正在參加其他臨床研究的受試者。

1.5 分組

將全部患者隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，其中對(duì)照組 30 例，男11例，女19例，年齡 19～64歲，平均年齡(40.55±12.18)歲，病程 2～17個(gè)月，平均病程(5.32±2.89)個(gè)月，平均創(chuàng)面面積(6.43±2.18)cm2。觀察組30 例，男 9例，女21例，年齡18～65歲，平均年齡(42.23±12.88)歲，病程 3～19個(gè)月，平均病程(5.65±2.21)個(gè)月，平均創(chuàng)面面積(5.91±2.33)cm2。2組患者性別、年齡、病程、創(chuàng)面面積等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.6 治療

2組患者全部給予3HREZ/9HRE為代表的抗結(jié)核治療方案,早期、聯(lián)合、適量、規(guī)律、全程抗結(jié)核治療。膿腫成熟自行破潰或切開引流后形成結(jié)核性潰瘍，并予以局部換藥。對(duì)照組根據(jù)潰瘍面積及竇道深淺，剪取適當(dāng)脫脂棉片，參考韓東等臨床經(jīng)驗(yàn)[10]采用康復(fù)新液(湖南科倫制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字Z180609)浸濕后外敷；觀察組以復(fù)方五鳳草藥液浸濕的棉片外敷，隔日換藥1次。

復(fù)方五鳳草液制備：澤漆2000 g (大戟科草本植物澤漆EuphorbiahelioscopiaL.的地上部分，產(chǎn)自安徽，貨號(hào)180320)，貓爪草400 g (毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根，產(chǎn)自河南，貨號(hào)180416)、白及240 g (蘭科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥塊莖，產(chǎn)自江西，貨號(hào)180731)，由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供。將以上諸藥加水浸過(guò)藥面煎煮3次，每次1 h，合并煎液濾過(guò)，藥液濃縮分裝制成復(fù)方五鳳草液備用。所有藥液均由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥制劑室制備提供。

1.7 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

參照《中醫(yī)外科常見病診療指南》制定[11]，分為治愈、顯效、有效、無(wú)效4級(jí)。治愈：局部癥狀明顯改善，潰瘍創(chuàng)面完全或基本愈合，積分減少>90% ;顯效：局部癥狀明顯改善，潰瘍創(chuàng)面明顯縮小局限，積分減少70% ～ 90% ;有效：局部癥狀好轉(zhuǎn)，潰瘍創(chuàng)面及病灶縮小，積分減少 30% ～ 69% ;無(wú)效：局部癥狀無(wú)明顯改善甚或加重，積分減少<30%。愈顯率(%)=(治愈例數(shù)+顯效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.8 局部體征積分改善情況

結(jié)核性潰瘍以其局部體征為觀察指標(biāo)，參考以往課題組量化標(biāo)準(zhǔn)[12]，重點(diǎn)觀察局部潰瘍創(chuàng)面的分泌物(形質(zhì)、色澤、量)、腐肉(量、腐脫程度)、肉芽(色澤、量)、上皮組織(量)、竇道長(zhǎng)短、創(chuàng)周(皮色、腫脹程度)等指標(biāo)。按照各指標(biāo)輕重程度分為 5 級(jí)，分別計(jì)0、1、2、3、4分。于給藥前及給藥后每周各觀察記錄 1 次，統(tǒng)計(jì)各時(shí)間點(diǎn)體征指標(biāo)總積分情況。

1.9 ELISA檢測(cè)血漿TGF-β、TNF-α，肉芽組織IL-1、IL-6、NF-κB、VEGF、PDGF的含量

在給藥前和給藥第1、2、4周分別抽取患者晨起空腹全血2 mL，在4 ℃低溫2500 r/pm離心5 min。取上層血漿并在潰瘍創(chuàng)面取少量肉芽組織-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)時(shí)取適量血漿并勻漿肉芽組織，嚴(yán)格根據(jù)所測(cè)指標(biāo)說(shuō)明書要求進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品配置，加樣(稀釋1倍的樣本)之后根據(jù)要求進(jìn)行37 ℃恒溫箱孵育，依次加入生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液、底物溶液、終止液等。在加入終止液后，立即用酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek儀器有限公司,Victor3 plate reader)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量每個(gè)孔的光密度(OD值)。Human TNF-α ELISA Kit (E-EL-H0109c)，Human IL-1 ELISA Kit (E-EL-H0103c)；Human IL-6 ELISA Kit(E-EL-H0102c)；Human NF-κB ELISA Kit (E-EL-H1386c)，均購(gòu)自伊萊瑞特生物科技公司；Human TGF-β ELISA Kit(JL20082-96T)、Human VEGF ELISA Kit(JL19608 -96T)、Human PDGF ELISA Kit (JL15347-96T)均購(gòu)自江萊生物公司。

1.10 qPCR檢測(cè)肉芽組織TGF-β、TNF-αmRNA表達(dá)

在給藥前和給藥第1、2、4周治療后取創(chuàng)面少量肉芽組織于凍存管，-80 ℃冰箱保存待檢。引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成,TGF-β(329bp)引物上游5′-CATCAACGGGTTCACTACC-3′,下游5′-CTCCGTGGAGCTGAAGCA -3′;TNF-α(169bp)引物上游5′-CGAGTCTGGGCAGGTCTA-3′,下游5′-GTGGTGGTCTTGTTGCTTAA-3′;β-肌動(dòng)蛋白 (β-actin)；引物上游5′-TCAGGTCAT CACTAT CGGCAAT-3′,下游5′-AAAGAAAGGGTGTAAAA CGCA-3′。提取創(chuàng)面肉芽組織總RNA,檢測(cè)總RNA的純度、濃度及其完整性。總RNA提取后,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用PrimeScriptTMPT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒(Takara，RR036A),ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix (Without ROX)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，Q321-02)相應(yīng)反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.11 創(chuàng)面大體觀及組織病理學(xué)改變

患者在給藥前和給藥4周后比較患者創(chuàng)面大體觀變化，同時(shí)在創(chuàng)面取新鮮肉芽組織標(biāo)本，用10%多聚甲醛固定，經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋后做常規(guī)石蠟切片，將切片脫蠟、復(fù)水、染色、脫水、透明、封藏后在 400 倍視野(德國(guó)徠卡微系統(tǒng)有限公司，DM3000顯微鏡)下觀察創(chuàng)面肉芽組織病理學(xué)變化。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2組均完成治療研究，無(wú)不良事件發(fā)生，無(wú)脫落以及失訪病例，全部病例進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析。

2.1 2組臨床療效比較

表1示，觀察組總體療效明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 2組總有效率比較 [例(%)]

2.2 2組患者各時(shí)間點(diǎn)局部體征積分比較

表2示，與給藥前比較，2組患者在給藥后第1、2、4周局部體征積分均明顯下降(P<0.05或P<0.01);與對(duì)照組比較，觀察組治療后第4周局部體征總積分下降更明顯(P<0.01)。

表2 2組患者各時(shí)間點(diǎn)局部體征積分比較 (分值，

2.3 2組患者血漿TGF-β、TNF-α，肉芽組織IL-1、IL-6、NF-κB、VEGF、PDGF含量比較

表3、4示，給藥前2組患者血漿TGF-β、TNF-α，肉芽組織中IL-1、IL-6、NF-κB、VEGF、PDGF的含量，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療2周后對(duì)照組和觀察組患者血漿TNF-α，肉芽組織中IL-1、IL-6、NF-κB含量減少，血漿TGF-β、肉芽組織VEGF、PDGF含量顯著增加(P<0.05或P<0.01)。4周后與對(duì)照組比較，觀察組療效更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表3 2組患者各時(shí)間點(diǎn)血漿中細(xì)胞因子含量比較

表4 2組患者各時(shí)間點(diǎn)肉芽組織中細(xì)胞因子含量比較

2.4 2組患者肉芽組織TGF-β、TNF-α mRNA表達(dá)比較

表5示，比較給藥前2組患者肉芽組織TGF-β、TNF-α mRNA表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2周后各組患者肉芽組織TGF-β mRNA表達(dá)水平升高，TNF-α mRNA表達(dá)下降(P<0.01)；4周后與對(duì)照組比較，觀察組患者肉芽組織TGF-β mRNA表達(dá)水平更高，TNF-α mRNA表達(dá)更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表5 2組患者不同時(shí)間點(diǎn)肉芽組織TGF-β、TNF-α mRNA表達(dá)比較

2.5 患者創(chuàng)面大體觀及組織病理學(xué)改變

圖1示，給藥前患者創(chuàng)面膚色黯淡，存在大量壞死組織和敗絮樣膿性分泌物,創(chuàng)面及皮下膿腫包塊明顯；給藥2周后，創(chuàng)面滲液及膿腫分泌物明顯減少，皮下壞死組織形成的膿腫包塊明顯減小；外敷給藥4周后，患者創(chuàng)面及其周圍水腫均明顯消退,患者創(chuàng)面結(jié)痂。

圖1 干預(yù)給藥前、給藥2周/4周后觀察組患者創(chuàng)面大體形態(tài)

圖2示，給藥前鏡下可見大量類上皮細(xì)胞和朗罕氏巨細(xì)胞伴淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn),并伴微膿腫形成；給藥2周后，仍可見部分類上皮細(xì)胞和朗罕氏巨細(xì)胞伴淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；給藥4周后，可見大量新生的毛細(xì)血管和膠原纖維伴少許組織細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

注：a.膿腫；b.朗罕氏巨噬細(xì)胞；c.炎性細(xì)胞；d.新生毛細(xì)血管；e.膠原纖維(HE×400)圖2 給藥前、給藥2周/4周后觀察組患者肉芽組織病理變化比較

3 討論

結(jié)核性潰瘍是肺外結(jié)核最為常見的疾病之一，主要見于淋巴結(jié)核、骨結(jié)核等病變中后期膿腫破潰后形成的創(chuàng)面，或可見于淺表皮膚創(chuàng)面，因病程中感染結(jié)核桿菌后形成的慢性難愈性潰瘍。其具有創(chuàng)面不易愈合、病程纏綿、容易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，屬于臨床難治痼疾，給患者、社會(huì)、醫(yī)療體系造成巨大負(fù)擔(dān)[13]。本病屬于中醫(yī)學(xué)“瘡瘍”范疇，多因患者素體正氣虧虛、氣血不足或陰虛火旺，又感邪毒癆蟲，局部氣血凝滯，郁而化熱，蘊(yùn)蒸釀膿，潰破膿出，淋漓不盡，導(dǎo)致“腐肉難去，新肉不生”，而形成慢性難愈性潰瘍，致其發(fā)展為竇道、瘺管。《外科正宗·癰疽治法總論》云：“膿出方自腐脫，腐脫方自生肌，肌生方自收斂，收斂方自瘡平。[24]”基于此理論，我科篩選名醫(yī)經(jīng)驗(yàn)良方，選取五鳳草以行水消腫、殺蟲解毒、祛腐生肌[14]；白及以收斂止血，消腫生肌；貓爪草以消腫散結(jié)，化痰解毒，3味藥并用共奏提膿去腐、活血生肌之效[3]。

有研究表明，患者感染結(jié)核桿菌后全身免疫系統(tǒng)被激活，血清炎癥因子TNF-α含量升高[22]，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)患者血漿進(jìn)行了檢測(cè)分析，以輔助檢測(cè)結(jié)核病的治療情況。同時(shí)對(duì)創(chuàng)面肉芽組織的觀察、檢測(cè)分析，是為研究復(fù)方五鳳草對(duì)潰瘍創(chuàng)面組織的直接作用。此外，本試驗(yàn)選擇給藥前、給藥后1周、2周、4周作為臨床觀察時(shí)間點(diǎn)，能全面反映復(fù)方五鳳草液在治療各個(gè)階段對(duì)創(chuàng)面的影響及作用機(jī)制。最終本實(shí)驗(yàn)證明，在給藥2周后復(fù)方五鳳草液就能顯著改善患者局部體征積分，減少膿液分泌，加快腐肉脫落，促進(jìn)健康新生肉芽生長(zhǎng)和創(chuàng)面的愈合；給藥4周后與康復(fù)新液比較，復(fù)方五鳳草液能明顯提高患者血漿TGF-β、TNF-α，肉芽組織IL-1、IL-6、NF-κB、VEGF、PDGF的含量，表明復(fù)方五鳳草液能有效促進(jìn)結(jié)核性潰瘍患者創(chuàng)面的愈合，其作用機(jī)制可能與降低TNF-α通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平，提高TGF-β相關(guān)生物因子的表達(dá)水平相關(guān)。

TNF-α是由巨噬細(xì)胞分泌的一種小分子蛋白，是傷口愈合的生物標(biāo)志物之一。TNF-α的分泌進(jìn)一步增加血管通透性,使補(bǔ)體等效應(yīng)分子與效應(yīng)細(xì)胞穿過(guò)血管壁到達(dá)感染部位,繼而誘導(dǎo)下游IL-1、L-6及NF-κB等炎癥因子的大量釋放，而IL-1、L-6及NF-κB等炎癥因子能促進(jìn)中性粒細(xì)胞的氧化反應(yīng)，使組織的炎癥反應(yīng)呈持續(xù)狀態(tài)[18]。本次實(shí)驗(yàn)中，患者血漿和肉芽組織中TNF-α、IL-1、L-6及NF-κB等炎癥因子表達(dá)，隨給藥時(shí)間的增加而逐漸降低，潰瘍創(chuàng)面炎癥狀態(tài)逐漸改善，可見復(fù)方五鳳草液具有一定的抗炎作用。

潰瘍創(chuàng)面的愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及細(xì)胞遷移和炎癥，成纖維細(xì)胞增殖并形成肉芽組織和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積，以及瘢痕組織在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)重塑[15]。TGF-β是生長(zhǎng)和分化因子家族的原型，由哺乳動(dòng)物中的33個(gè)基因編碼，并包含同二聚體和異二聚體。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了TGF-β通過(guò)對(duì)多種細(xì)胞類型的作用來(lái)調(diào)節(jié)這些不同的步驟，并在體內(nèi)促進(jìn)傷口愈合過(guò)程[16，17]。實(shí)際上，TGF-β可以通過(guò)吸引成纖維細(xì)胞和血小板到炎癥和修復(fù)部位，高效誘導(dǎo) ECM 蛋白的表達(dá)，并抑制ECM降解等方式介導(dǎo)創(chuàng)面的纖維化，強(qiáng)烈地促進(jìn)體內(nèi)創(chuàng)面的愈合[15]。本次臨床實(shí)驗(yàn)中，在外敷復(fù)方五鳳草液后創(chuàng)面肉芽組織中TGF-β的轉(zhuǎn)錄和翻譯明顯增加，并誘導(dǎo)角質(zhì)蛋白細(xì)胞釋放VEGF 因子，血小板釋放PDCG因子，促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面微血管和新鮮肉芽組織的形成，提高創(chuàng)面血供，加速創(chuàng)面愈合。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TNF-α和TGF-β在復(fù)方五鳳草液促進(jìn)結(jié)核性潰瘍創(chuàng)面愈合過(guò)程中起到重要調(diào)節(jié)作用。在治療期間較之對(duì)照組，觀察組創(chuàng)面肉芽組織中TGF-β mRNA表達(dá)明顯升高，TNF-α mRNA表達(dá)明顯降低,表明復(fù)方五鳳草液可提高創(chuàng)面肉芽組織TGF-β mRNA表達(dá)，并激活下游VEGF 因子和PDCG因子，以促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面的愈合；同時(shí)可降低TNF-α mRNA表達(dá)，減少下游IL-1、L-6及NF-κB等炎癥因子釋放，以抑制潰瘍創(chuàng)面的局部炎癥反應(yīng)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)表明，復(fù)方五鳳草液中有大量的酚酸、黃酮類化合物[19]，其中沒(méi)食子酸可抑制TNF-α的表達(dá)[20],金絲桃苷能促進(jìn)TGF-β mRNA表達(dá)[21]。同時(shí)血漿TGF-β和TNF-α含量的變化趨勢(shì)也與文獻(xiàn)報(bào)道一致，對(duì)結(jié)核病的抑制有正向作用[7]。

綜上，復(fù)方五鳳草液可促進(jìn)結(jié)核性潰瘍創(chuàng)面的愈合，而TGF-β和TNF-α可從正負(fù)兩個(gè)方面調(diào)控結(jié)核性潰瘍的創(chuàng)面修復(fù)，可視為復(fù)方五鳳草液促進(jìn)結(jié)核性潰瘍創(chuàng)面修復(fù)的機(jī)制之一。