骨關節炎軟骨缺損修復的動物實驗研究?

張熙南，張君濤，靳 博

(天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的關節退行性疾病，可累及1個或多個關節。有數據顯示，在60歲以上人群中，9.6%的男性和18%的女性患有癥狀性的OA[1，2]，其結構改變常表現為關節軟骨缺損、骨贅形成、軟骨下骨硬化及周圍軟組織黏連等[3]。臨床治療主要包括藥物、理療、手術等，但效果并不理想。近年來，隨著組織工程學的發展，通過軟骨再生提供生物學的解決方案成為OA的治療前景，即通過干細胞培養、組織工程支架及生長因子等提高軟骨的再生潛力，降低炎癥反應的同時，達到修復軟骨缺損的目的。

在進入臨床治療之前，動物實驗研究對于檢驗軟骨組織工程的安全性及有效性具有重要作用，這些模型不僅可模擬人類關節軟骨缺損不同時期的不同形態，還可彌補體外研究和人體臨床實驗之間的差距。同時，隨著關節軟骨修復重建的方法越來越多，對動物模型的準確性及規范性要求也越來越高。如何合理地將動物模型與軟骨組織工程相結合，把軟骨再生從理想帶入現實等都是迫切需要解決的問題[4，5]。因此，本文對現有的動物關節軟骨缺損修復的相關文獻進行述評，現報道如下。

1 現代醫學軟骨缺損修復的相關研究

1.1 多種細胞誘導軟骨再生

早期用于修復軟骨缺損的細胞療法就是基于軟骨細胞開展的。Brittberg M等[6]首先運用自體軟骨細胞移植術治療OA，但由于難以獲得足夠數量的軟骨細胞和供體部位發病率等問題，其效果并不理想。隨著人工細胞載體和新培養方法的引入，利用軟骨細胞修復軟骨缺損的方法再次受到關注。Nixon AJ等[7]將馬自體軟骨細胞接種到I型或III型膠原膜上，并植入到股骨滑車脊缺陷中，觀察到缺陷處軟骨生長良好，II型膠原蛋白含量增加，且軟骨下骨或軟骨對植入物的排斥反應很小。Bothe F等[8]通過豬的實驗模型發現，豬幼崽的軟骨細胞生長速度明顯快于成年豬軟骨細胞，軟骨形態更接近于天然軟骨，具有更高的蛋白多糖和II型膠原蛋白。但軟骨細胞在體外培養的過程中，存在細胞去分化及表型缺失等問題。因此，如何尋找一種高表達、低分化的細胞，成為研究軟骨再生的突破口。

多能干細胞具有分化成多種組織類型的能力，并且可無限制地生成具有低轉換率且難以獲得的細胞類型。盡管以前認為成熟的胚胎干細胞只能分化成具有組織或器官特征的細胞譜系，但最近的研究表明，成熟的多能干細胞在軟組織損傷、骨損傷、創傷愈合和衰老過程中都能參與修復過程。Rim YA等[9]將多能干細胞誘導分化成軟骨細胞后植入大鼠的OA模型，證實了多能干細胞衍生的軟骨細胞用于軟骨修復的可能性。Xu等[10]向家兔的軟骨缺陷模型中植入由誘導多能干細胞衍生的間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MCS)，發現軟骨缺損處重新再生出軟骨樣組織并得出結論，多能干細胞具有修復軟骨缺損的潛力。然而多能干細胞可能存在致瘤性及倫理等問題，但部分學者認為其致瘤性與多因素相關。最近的研究顯示，移植細胞的數量與它們和受體的組織相容性程度、宿主的免疫抑制和移植部位等共同決定多能干細胞的致瘤性。Pilichi S等[11]通過4年的綿羊動物實驗，證實胚胎干細胞用于軟骨再生工程的安全性和可靠性。

此外，MCS以其高增殖、多能分化及極少致瘤性的特點備受青睞。目前采用骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)修復軟骨缺損的技術已經進入臨床。Khalilifar MA等[12]將家兔BMSCs在體外培養擴增，接種在支架材料上并植入家兔軟骨缺損模型中，4周后發現軟骨缺損得到明顯改善。脂肪來源的間充質干細胞(adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs)也是一種較好的選擇。小鼠實驗證實，ADSC雖比BMSC形成的軟骨數量少，但ADSCs來源更豐富，且更容易獲得。滑膜間充質干細胞(synovial mesenchymal stem cells，SMSCs)在軟骨再生能力方面優于骨髓和脂肪來源的MSC。有數據顯示，與BMSCs比較，SMSCs誘導形成的軟骨組織數量增加了9倍，硫酸蛋白多糖沉積增加了13倍。但由于SMSCs保留了一些成纖維細胞的能力以及較低的分離效率，限制了其在軟骨組織工程中的應用[13]。此外，將不同種類的MSC混合培養以后，共培養體系中MSC具有更高的增殖潛力，更適合于軟骨再生的選擇。

1.2 支架材料促進軟骨缺損修復

對于組織工程而言，支架材料對于軟骨再生至關重要。支架的結構、生物力學和生物化學特性可以影響細胞的存活率和分化能力。用于軟骨組織工程的支架主要包括天然聚合物、合成聚合物以及含有生物材料組合的復合聚合物。天然聚合物由于生物相容性好、細胞毒性低、可降解等優點已被大量用于實驗研究。Chen Y等[14]以絲素蛋白-多孔明膠(silk fibroin-porous gelatin scaffold，GSTS)構成可持續釋放負載基質細胞衍生因子1α和轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的緩釋支架，與BMSCs一同接種到大鼠膝關節骨軟骨缺損處，發現GSTS可通過促進BMSCs歸巢和軟骨的形成分化來增強軟骨修復。藻酸鹽、殼聚糖等這一類以碳水化合物為主的天然支架，因其具有捕獲自由基形成穩定大分子的功能，可增強細胞的附著和增殖能力。Erickson AE等[15]基于軟骨包括關節軟骨和軟骨下骨的理念，設計出符合生物化學和生物力學要求的雙層殼聚糖支架，可同時搭載成骨細胞和軟骨細胞，產生具有類似于天然骨軟骨組織的再生軟骨。但Huang等[16]認為，天然聚合物形成的支架材料存在機械強度差、易受物理變化影響的弊端，很難作為長期植入材料使用。

合成聚合物相較于天然聚合物來說具有良好的機械性能。Jiang等[17]發現，聚己內酯-聚四氫呋喃形成的支架具有誘導大鼠MSC軟骨形成和加速受損軟骨表面再生的能力。有學者通過豬的模型發現，聚乳酸-羥基乙酸聚合物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)支架，可促進骨軟骨再生[18]。然而，合成聚合物在降解時釋放酸性物質容易導致局部酸中毒，其安全性有待提高。生物陶瓷形成的支架具有較好的生物活性，能與骨骼形成快速而強烈的黏合，且不存在生物毒性。Bunpetch V等[19]通過硅酸鹽基生物陶瓷支架搭載BMSCs注入家兔髕骨軟骨缺損處，發現軟骨和軟骨下骨再生，并且在體外培養過程中還發現硅酸鹽基生物陶瓷支架有助于維持軟骨細胞表型。

近年來，隨著各種新型可注射性醫用材料的出現，雙層支架以及聯合蛋白質、生物活性物質等形成的復合支架成為研究熱點。這些復合支架既解決了生物相容性的問題，又能滿足生物力學的需要，還可以通過激活信號通路提高促表達能力。

1.3 生長因子調控軟骨細胞形成

生長因子作為一種生物活性多肽，可以刺激細胞分裂、生長和分化。在關節軟骨中，許多生長因子共同調節關節軟骨的發育和體內平衡。有研究證實，生長因子可刺激軟骨細胞合成蛋白多糖、蛋白聚糖和 II 型膠原，誘導滑膜細胞和BMSCs增殖，促進BMSCs向軟骨分化[20]。Ongchai S等[21]利用馬實驗模型發現，TGF-β1對馬軟骨細胞具有刺激作用，可增強透明質酸的合成，并促進軟骨基質產生。但Murata K[22]卻認為，TGF-β1與骨關節炎過程中骨贅的形成有關，TGF-β1應用于軟骨組織工程時需考慮其可能產生的副作用。胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor 1，IGF-1)具有維持關節軟骨完整性，誘導關節軟骨修復的同時降低其分解代謝的能力。Peng等[23]研究發現，IGF-1對BMSCs向軟骨細胞形成分化具有促進作用，同時能提高II型膠原蛋白表達，其機制與IGF-1能抑制線粒體膜電位的喪失，阻止線粒體通透性轉換孔的開放和細胞內活性氧的釋放有關。

成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)廣泛存在于各種組織中。Endo K等[24]通過FGF-2實現了犬MCS向軟骨細胞的分化，促成了軟骨再生。此外，FGF既能通過與細胞表面受體結合，促進合成代謝降低分解，又能在高濃度狀態下降低脂多糖刺激的滑膜成纖維細胞中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)的表達水平，參與骨關節炎的過程。而血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)作為MCS的趨化因子，具有增加蛋白多糖的產生和增殖細胞的作用。有學者發現，重組血小板衍生生長因子-BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)能顯著改善軟骨細胞對 II 型膠原的合成代謝過程，抑制軟骨細胞體積增大，減緩大鼠骨關節炎的進展，且PDGF-BB還能促進血管生成，改善軟骨的血供[25]。此外，通過多模式的聯合可大幅度提高軟骨再生能力，但由于其可變因素較多，使得再生軟骨達不到預期效果，并且過表達現象也是需要解決的問題(見表1)。

表1 各種誘導軟骨再生方式的優缺點

2 中藥在軟骨缺損修復中的作用研究

OA屬于中醫學痹證范疇。《素問·痹論篇》中認為，其病因是“風寒濕三氣雜至，合而為痹也”，同時《靈樞·刺節真邪》提到“虛邪之中人也，灑淅動形，起毫毛而發腠理。其入深，內搏于骨，則為骨痹”。中醫藥在治療OA時表現出獨特優勢，其主要作用在于緩解疼痛、改善膝關節功能[26]。其中針刺、艾灸、按摩等在抑制相關炎癥因子的表達，調控信號通路，減輕炎癥反應等方面效果良好，但對于軟骨缺損的修復卻收效甚微。

中藥在治療OA時，既可通過抑制炎性因子的表達減緩軟骨細胞損傷，又可通過調節各種生長因子刺激軟骨細胞生長。此外，通過辨證論治可以滿足不同患者的個性化需求。但由于中藥成分較復雜，且在治療OA的過程中并不單一發揮作用[27]，所以針對中藥修復軟骨缺損的研究，既需要掌握傳統中醫理論及中藥特性，又需要結合現代的藥物研究方法。在研究的過程中，主要依據中藥的功效類型，并將其分為補腎強骨類、化瘀止痛類、行氣活血類、清熱利濕類。

2.1 補腎強骨類

“腎主骨生髓”的理論來源于《黃帝內經》，腎虛血瘀貫穿整個OA的病理過程，所以補腎強骨是治療OA的關鍵。淫羊藿具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效。Mi B等[28]通過大鼠實驗研究證實，淫羊藿苷可通過下調軟骨細胞核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號介導的軟骨細胞凋亡，促進成骨細胞的增殖和分化，抑制破骨細胞生成，從而減緩骨關節炎軟骨退化。同時，淫羊藿苷還能通過調節TDP 43基因，抑制關節軟骨細胞的凋亡，同時增加滑膜組織中新血管的形成。此外，有學者將淫羊藿苷含藥血清和透明質酸結合注射到家兔OA模型中，發現可以促進軟骨缺損的修復，并增加新的軟骨形成[29]。

牛膝是治療OA的常用中藥，具有補肝腎、強筋骨的作用。Xu等[30]發現，牛膝可以通過下調基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)3和9以及環加氧酶-2的表達，減輕IL-1β誘導的炎癥和基質降解，從而抑制大鼠軟骨細胞中IL-1β誘導的NF-κB活化，從而抑制OA的進展。此外，牛膝還可以誘導β-連環蛋白核轉位，使β-連環蛋白和細胞周期蛋白D1的表達，被Dickkopf-1因子部分抑制，從而激活Wnt/β-連環蛋白信號傳導途徑，促進軟骨細胞增殖，增加軟骨細胞中II型膠原的表達[31]。

鹿茸是溫補腎陽的要藥，具有補腎陽、益精血、強筋骨的功效。Wang等[32]將鹿茸多肽與絲素蛋白/膠原/透明質酸制備成復合支架共同植入兔軟骨缺損模型中，13周后發現軟骨缺損幾乎完全修復，且與單純使用絲素蛋白/膠原/透明質酸復合支架相比，結合鹿茸多肽的支架，可明顯提高軟骨缺損修復能力。

2.2 化瘀止痛類

《素問·舉痛論篇》中認為，疼痛是“痛而閉不通”。而痹證多由“外邪”閉阻經絡，導致氣血運行不暢所致，所以臨床在治療OA時常配伍一些舒經活絡、散瘀止痛的藥物。虎杖具有清熱解毒、散瘀止痛的功效。Deng等[33]發現，虎杖可以通過影響NF-κB調節MMP基因的表達來抑制OA的進展。此外，虎杖還可通過激活SIRT1基因，促進MSC向軟骨細胞分化，同時抑制IL-1β和TNF-α的表達，以修復關節軟骨缺損[34]。

紅花具有活血通經、散瘀止痛的作用。羥基紅花黃色素是醫療和食用兩用植物紅花中的主要活性成分。Hu等[35]通過小鼠OA模型發現，它可通過降低MMP和血小板反應蛋白基序5的表達，減弱IL-1β誘導的細胞外基質的降解，同時抑制IL-1β誘導NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)級聯的激活，從而達到保護軟骨細胞的作用。

葛根在治療OA時主要發揮其通筋活絡的功效。Wang等[36]發現，葛根可通過上調OA大鼠中單磷酸腺苷活化蛋白激酶(amp-activated protein kinase，AMPK)增殖物激活受體-γ共激活因子信號通路來減輕OA。同時，葛根還可降低小鼠OA組織中C-C趨化因子配體2的表達，限制炎性單核細胞的聚集。

2.3 行氣活血類

基于《醫宗必讀·痹》所論：“治風先治血，血行風自滅”[37]，在治療以OA為主的痹證時，會添加一些以行氣活血為主的中藥。川芎具有活血行氣、祛風止痛的功效。Li等[38]通過大鼠OA模型發現，川芎嗪可通過抑制SIRT1基因或NF-κB通路，激活核轉錄因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-derived 2-like 2，Nrf2)或血氧合酶1(hemooxygenase 1，HO-1)通路，從而降低IL-1β和TNF-α的血清水平，減輕OA的進展。同時川芎嗪還可通過調節SOX9基因和NF-κB信號通路，使軟骨細胞免受IL-1β誘導的損傷[39]。

姜黃具有破血行氣、通經止痛的作用。Feng等[40]通過大鼠OA模型發現，姜黃素可通過促進軟骨細胞中SIRT1基因表達，而抑制內質網應激相關的蛋白激酶R樣內質網激酶真核翻譯起始因子同源蛋白通路(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase-eukaryotic translation initiation factor 2-C/EBP homologous protein，PERK-eIF2-CHOP)，降低軟骨細胞的內質網應激，減緩OA的發展。

黃芪是補氣運脾的要藥，具有補中益氣、升陽舉陷的功效，臨床中常用于治療氣虛或氣陷等病證，并不是治療OA的常用藥。但Li等[41]卻發現，黃芪可通過抑制IL-1β誘導的炎性因子，包括IL-6、TNF-α、NO、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、MMP13和含Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-like motifs 5，ADAMTS-5)的表達，以及NF-κB信號的激活，從而改善OA小鼠模型中軟骨的損傷。此外作者還發現，黃芪可通過上調軟骨細胞自噬活性，抵抗IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡。

2.4 清熱利濕類

《癥因脈治·痹癥論》首次系統地對“熱痹”這種特殊的類型予以論述，當關節出現紅腫疼痛時可以清熱利濕為主要治療方法[42]。黃芩和黃連都具有清熱燥濕、瀉火解毒的作用。Chen等[43]通過小鼠OA模型發現，黃芩可顯著抑制IL-1β刺激的NF-κB活化，不僅防止軟骨的破壞，還減輕了OA模型小鼠的滑膜炎。

大黃具有清熱瀉火、涼血解毒的功效。Ding等[44]向大鼠OA模型中注射大黃素，發現大黃素能下調IL-1β刺激的大鼠軟骨細胞中MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5 mRNA和蛋白質的表達，減弱IL-1β誘導的NF-κB和Wnt信號激活，改善OA的進展。

綜上表明，中藥運用于軟骨工程時，其作用主要通過抑制促炎細胞因子的活動，調節活性氧誘導的線粒體信號傳導，下調MAPK和Wnt/β-catenin信號表達，以及對MMP和ADAMTS活性的抑制與合成代謝活性的增加來調控軟骨缺損的修復。但中藥在OA中的作用尚未完全闡明，且針對中藥復方的研究較少，由于其成分多樣性的特點，使得其研究方法較局限。此外，中藥單體作用能力有限，存在新生軟骨數量少、軟骨成分中纖維軟骨數量多、與關節形合度差等問題。所以，通過將中藥與種子細胞、支架材料及生長因子等相結合的方法，既能改善OA模型中的“微環境”，減輕炎癥反應導致的軟骨損傷，又能調節并維持軟骨細胞表型，促進干細胞向軟骨的定向分化，從而減緩OA的進展。

3 總結與展望

近年來，軟骨組織工程發展迅速，開辟了許多新的方法。無論是針對哪種方法的研究，其目的都是為了減緩軟骨缺損的進展，促進軟骨或軟骨細胞再生，提高再生軟骨中透明軟骨的含量。動物實驗作為體外研究和人類臨床應用之間的過渡階段，通常從細胞層面分析細胞表型的缺失和致瘤性，評估生物材料的生物相容性、毒性和降解能力。本文系統闡述了軟骨缺損修復的動物實驗研究進展，在結合中醫理論及現代藥學研究方法的基礎上，重點敘述了中藥在軟骨工程中的研究現狀。但由于軟骨再生的過程中可變因素較多，再生軟骨無論從數量或者生物學特性上均達不到預期效果，所以目前還沒有發現與天然軟骨相似的工程軟骨。

在今后的研究中，對種子細胞的研究不僅需要獲得穩定的軟骨細胞表型，防止軟骨基質和細胞退化，同時還要提高軟骨細胞的表達能力，讓II型膠原蛋白得到高表達。軟骨工程的支架材料既要在體內達到無毒降解，也要在保證機械強度的同時提高組織和細胞相容性，便于誘導細胞生長和分化，同時限制細胞遷移。生長因子則需要解決使用相關蛋白質結構不穩定、免疫原性高、易形成炎癥因子等不良反應以及如何避免負載材料與生長因子發生反應等問題。此外，中藥在抑制炎癥反應的過程中表現良好，如何將研究由中藥單體轉變為中藥復方以提高再生軟骨的數量及質量是今后需要努力的方向。將中藥的研究加入到種子細胞、支架材料、生長因子這“三大基石”中，讓其形成“四足鼎立”的局面，以便于在減輕OA癥狀的同時也能使軟骨缺損得到修復。希望能將部分動物研究的成果盡快轉化到臨床，改善軟骨缺損的治療現狀，提高患者生活質量。