和田地區規模化鴨場鴨圓環病毒感染情況調查

姜水兵，努爾麥麥提·麥麥提敏

（塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

圓環病毒在近些年備受獸醫界的關注，圓環病毒科成員在顆粒形態及基因組方面均類似，但是在生態學、生物學、抗原性等方面差異比較大。關于鴨圓環病毒（DuCV）報道最早于2003年由德國學者Hattermann等［1］報道，隨后2004年德國［2］、2005年匈牙利［3］也相繼報道，自2007年起，在山東、江蘇、四川、福建、廣東、浙江、遼寧、重慶等省份陸續有鴨群感染DuCV報道［4］，DuCV感染后不僅可使鴨發生原發性感染，還會使鴨免疫系統受到損害，易遭受其他細菌和病毒的并發或繼發感染，給全球養鴨業造成了巨大的經濟損失［5］。因為DuCV在動物細胞和禽胚上的增殖培養方法尚未建立，故無法采用傳統的病毒分離鑒定方法進行準確診斷，而根據流行病學、臨床癥狀、病理變化等也只能做出初步診斷，確診需借助實驗室診斷方法。

楊曉偉等［6］研究發現鴨圓環病毒病在川渝地區存在低水平感染。廣西同時存在基因1.1亞型、基因1.2亞型和基因2.1亞型3種不同的DuCV毒株流行，其中基因1.1亞型和1.2亞型為優勢流行毒株［7］。江西部分地區鴨圓環病毒病的流行較為嚴重，且優勢基因型為1型［8］。由于DuCV常以隱性感染形式存在，易被忽視，從而為DuCV的傳播、適應與變異提供了更多機會。為明確DuCV在和田地區的感染與流行情況，本研究對和田地區疑似發病鴨群進行了DuCV的檢測與全基因組測序分析，旨在了解DuCV流行毒株在和田地區的遺傳變異情況和流行優勢基因型，為和田地區防控DuCV提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集 采自和田地區5個規?；B殖場15～30日齡的櫻桃谷肉鴨，出現被羽脫落，生長遲緩等癥狀共100例病、死鴨樣品，無菌收集包括肝、脾、法氏囊等組織臟器，-20℃保存備用。

1.1.2 試劑 主要試劑：DNA zol、ExTaq酶、DNA Marker DL 2000，北京全式金生物技術有限公司；Gold View，北京博奧拓達科技有限公司；pMD18-T Vector，寶生物工程（大連）有限公司；E.coliDH5α株感受態細胞，天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA提取 將采集的肝、脾、法氏囊等器官組織樣品使用消毒過的手術剪各剪取黃豆大小的組織塊，將剪取的組織塊倒入加有5倍體積生理鹽水的研磨器中進行研磨，研磨后的組織液反復凍融3次，4℃8 000 r/min離心5 min，取上清并做好標記保存備用。處理好的樣品按照DNA zol試劑盒操作說明書提取病毒DNA。

1.2.2 引物合成 楊育鵬［9］發表的DuCV-1、DuCV-2特異性引物，DuCV-F：5'-CGACTTATGTTATCT TTGGGCGT-3'，DuCV-1R：5'-AATTCTGCGGTACA GAGA（C）TGA-3'，DuCV-2R：5'-AGCCTCAGAAA ACCAGATAATGCG-3'，其中DuCV-F為DuCV基因型的共用上游引物，與DuCV-1R特異性擴增長度為398 bp，與DuCV-2R特異性擴增長度為811 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 DuCV雙重PCR擴增、克隆及測序 PCR體系為25μL，其中模板DNA 2μL，上游引物0.5μL，下游引物各0.25μL，EasyTaqMix12μL，ddH2O10μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸30 s，35個循環，最后72℃延伸補齊5 min，以陽性樣本和ddH2O分別作陽性對照和空白對照。PCR產物取5μL經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果，陽性產物經膠回收，連接到pMD18-T載體，轉化宿主菌DH5α感受態細胞，經培養篩選，挑取單個轉化菌落于LB培養液（Amp+）過夜培養，PCR鑒定陽性克隆菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果用DNAStar進行拼接分析。

1.2.4 DuCV基因組序列分析 運用DNAStar7和Mega5對所獲得的和田毒株與GenBank中10個國內外DuCV毒株進行遺傳進化分析和同源性比較。

2 結果與分析

2.1 DuCV基因組PCR擴增結果

從鴨組織中提取總病毒DNA后用合成的特異性引物進行雙重PCR擴增，經過瓊脂凝膠電泳，通過全自動凝膠成像分析儀中觀察到了398 bp目的片段（圖1），未出現811 bp片段。

圖1 鴨圓環病毒PCR檢測結果

2.2 DuCV基因部分序列同源性分析

測序結果通過應用DNAStar軟件中的SeqMan對序列拼接，獲得4株DuCV部分基因序列，選取一株DuCV基因部分序列以MN068360.1為目標序列，選取11株國內外參考基因，其中與源自山東MN068358.1、臺灣KP229369.1、韓國KC851821.1同源性為100%，與韓國JQ740360.1、中國KC460533.1、廣西MK814581.1同源性為99.3%（表1、圖2）。

表1 參考DuCV毒株信息

圖2 參考DuCV毒株部分序列構建的同源性對比

2.3 DuCV部分基因序列系統進化樹

采用MEGA軟件將目標基因與11株參考序列繪制系統發育進化樹，由進化樹可知，本試驗獲得的毒株與源自山東的MN068358關系較近，屬于同一分支，與源自福建的GQ423740關系較遠（圖3）。

圖3 參考DuCV毒株部分序列系統進化分析

2.4 DuCV與鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒混合感染情況

經過對所有樣本進行PCR或RT-PCR檢測，在20份DuCV陽性樣本中，鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒的陽性率分別為10.00%（2/20）、30.00%（12/20）、5.00%（1/20）。剩余80份DuCV陰性樣本中，鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒的陽性率分別為8.75%（7/80）、25.00%（20/80）、3.75%（3/80）。結果顯示，DuCV陽性樣品中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒感染率均略高于DuCV陰性樣本（表2）。

表2 DuCV陽性或者陰性樣品中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒及呼腸孤病毒混合感染情況

3 小結與討論

自2003年德國學者Hattermann等［1］首次報道鴨圓環病毒以來，世界各地相繼報道其流行病學。本試驗采集和田地區5個規模化養殖場共100例病、死鴨樣品進行鴨圓環病毒檢測，結果表明，2021年采集的和田部分地區病、死鴨樣品DuCV陽性檢出率為20%，且優勢流行毒株為DuCV-1，低于高攀攀等［10］2020年采集的山東省部分地區DuCV陽性檢出率，同時與中國臺灣、匈牙利等地的DuCV感染率也有一定差異，說明DuCV感染呈現地域差異性。

DuCV陽性樣本與陰性樣本中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒及呼腸孤病毒混合感染的情況顯示，DuCV陽性樣本中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒感染率均略高于DuCV陰性樣本，表明DuCV病毒在侵入機體造成免疫損害后，易與其他病原微生物共染。

從DuCV毒株部分基因序列進化樹分析，和田流行優勢毒株與源自山東毒株關系最近，可能由于市場交易造成病原傳播。和田養鴨產業屬于國家扶持產業，種鴨、種蛋均由浙江大型養鴨場提供，建議養殖場在選擇引進適合本地養殖種鴨品種與種蛋的同時，做好種鴨疫病檢測、種蛋病原凈化；加強飼養管理，改善飼養環境，使用中草藥混合飼料，提高鴨群對疾病的抵抗力；做好DuCV-1型疫苗接種，定期檢測抗體水平。