lncRNAs在骨關節疾病中的作用研究進展

胡毅 成仕明 譚云

近些年來，骨關節疾病的發病率有明顯升高趨勢，且發病人群呈現年輕化的趨勢，骨關節疾病的主要表現為關節疼痛，隨著時間延長關節損傷逐漸加重，關節的反復疼痛讓患者受到極大的折磨[1]。骨關節疾病的致殘率較高，許多患者因關節疾病而失去行動自由，傳統的治療骨關節疾病診療手段不能在根本上解除患者疼痛，許多患者最終選擇采用關節置換術來提高生活質量[2]。隨著分子生物學技術的不斷發展，研究者在對骨關節疾病的診療方面也有重大突變，這給骨關節疾病患者帶來了福音。以往對基因功能研究更多的在編碼基因方面，對非編碼的基因關注度很低，隨著生物技術發展，已經完成可了多個基因組計劃，并且使用深度測序技術，多個研究者發現，有超過80%的基因組可被轉錄為RNA，有62%的基因組也發生轉錄，但轉錄為非編碼RNA(ncRNA)，這些ncRNA并不是大家所公認的“副產品”或者是“暗物質”，它的作用廣泛，可介導、調控或參與多種疾病的發生及發展進程[3]。依照非編碼RNA長度可分為>200核苷酸的lncRNAs及≤200核苷酸的短鏈非編碼RNA，≤200的RNA多為microRNA，近些年來，microRNA在多種疾病中的研究較多，大量研究表明，microRNA參與OA、RA、系統性硬化癥、系統性紅斑狼瘡等[4,5]。目前對lncRNAs的研究有限。lncRNAs的發現是多組學領域的一個重要的研究進展。研究顯示，lncRNAs可從轉錄水平、轉錄后水平及染色質重塑等多個層面上調控基因表達[6]。大量研究也證實，lncRNAs表達紊亂及調節失調可引起免疫功能失調、腫瘤及神經功能失調等多種疾病的發生[7]。近年來的研究證實，表觀遺傳學在OA、RA、骨腫瘤等骨和關節疾病發生發展中有重要作用[8]。多項研究表明lncRNA在骨關節疾病中的表達水平發生改變，但僅有少量的lncRNA功能被驗證[9]。這部分前人的研究成果解釋了lncRNA在骨關節疾病中的一些分子機制及重要功能，為今后lncRNA的研究提供了重要的線索。本文就lncRNA的生物學功能及在一些骨關節疾病中的相關研究作一綜述。

1 lncRNAs的概述

lncRNA是一類缺少可讀性及蛋白功能的RNA，存在帶多聚腺苷酸(polyA)尾及不帶多聚腺苷酸尾兩種形式，常常顯現出二級莖環樣結構或三級結構，是一類具有保守性的ncRNA[10]。由于lncRNA數量龐大、種類繁多，遠超過編碼疾病，因而目前對lncRNA尚沒有規范的分類方法，依據編碼基因和lncRNA在基因組中所處的位置，可將lncRNA分為正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因間lncRNA及內含子lncRNA。依據lncRNA的作用形式可將lncRNA分為順式lncRNA和反式lncRNA[11]。

隨著對lncRNA研究的深入，研究者發現，lncRNA比mRNA的表達譜有更加特異性，在不同的發病階段及所用的細胞和組織不同，所檢測的lncRNA表達可能會有所不同。同時lncRNA和mRNA間的表達譜也有相關性，以上的研究提示，在基因的表達網絡中，lncRNA可能是一類共調控基因[12,13]。許多lncRNA的亞細胞定位有特異性，如XIST位于失活的X染色體上、GAS5位于細胞質[14]。

lncRNAs可從多個水平調控基因表達，具有作用機制有以下幾個方面：直接與轉錄因子結合或協同作用，在轉錄水平影響靶基因表達，還可誘導基因活化加速，促發細胞轉錄程序，從而使轉錄進程加快[15]；可在翻譯水平參與多聚核糖體形成的調節，還可與真核生物翻譯其實因子相結合[16]；可參與染色質表觀修飾，通過對組蛋白乙?；揎椉叭旧|甲基化水平改變，從而調控靶基因表達[17]；可參與包括蛋白質泛素化修飾等翻譯后水平的調控[18]；可參與降解mRNA及mRNA選擇性剪接等轉錄后修飾[19]。

2 lncRNA與OA

趨化因子、氧化應激和代謝、生長因子等在OA發展進程中已經有大量的研究，但到目前為止，仍沒有一種能降低OA發生的有效方法。近年來，多項研究表明，lncRNA的表觀遺傳修飾在OA發展過程中有關鍵的作用。如Zhang等[20]研究顯示，lncRNA-UFC1在 OA患者中表達明顯降低，功能分析表明，UFC1對軟骨細胞有促增殖和抑凋亡作用，此外，UFC1通過調節mir-34a的影響OA軟骨細胞的存活，提示UFC1可能是OA診療的一個的潛在靶基因。Wang等[21]研究顯示，OA軟骨中lncRNA-UCA1上調表達，UCA1過表達可抑制軟骨細胞中mir-204-5p表達，mir-204-5p在OA軟骨中表達下調，mir-204-5p的表達與UCA1表達呈現負相關，過表達UCA1可促進軟骨細胞增殖，抑制Ⅱ型膠原和Ⅳ型膠原表達，而過表達mir-204-5p則抑制軟骨細胞的增殖，促進Ⅱ型膠原和Ⅳ型膠原表達，提示過表達UCA1可通過抑制mir-204-5p表達來調節軟骨細胞的增殖和膠原的表達。以上前人的研究提示lncRNA的表觀遺傳干預能力，可有望研制出有效的骨關節疾病靶向治療藥物。

lncRNA在多種疾病發生發展過程中有重要作用，但目前在OA中的發病機制尚未完全明確。在OA軟骨組織中lncRNA表達不一，有些lncRNA呈現高表達，有些lncRNA呈現低表達，均可通過不同的調節途徑影響OA進程。Fu等[22]采用高通量基因芯片技術研究膝關節OA軟骨組織中lncRNA表達譜的變化，發現上調的lncRNA有3 007種，下調的lncRNA有1 707種。Xing等[23]研究者也得出了同樣的結論。

2.1 H19印記基因 H19是一個位于染色體11p15.5上的2300bp長的呈現出父系印跡的lncRNA，在早期胚胎期中被發現，并呈現出高水平的表達，出生后表達量逐漸降低[24]。在多種腫瘤研究中發現，H19異常表達可影響腫瘤細胞生長，如王玨等[25]研究顯示，H19在胰腺癌細胞高表達，通過RNA干擾技術抑制其表達，發現抑制H19表達的胰腺癌細胞克隆形成數、細胞侵襲及轉移能力明顯提高；吳海權等[26]研究顯示，H19在人多形性膠質母細胞瘤(GBM)中呈現高表達，過表達H19可增強GBM增殖、侵襲和遷移能力，加速細胞周期S期進程，并抑制細胞凋亡，從而促進GBM的致癌性。一些研究也表明H19在OA軟骨組織中上調表達，在TNF-α及IL-1β刺激下H19在軟骨中的表達被抑制[23]。以上研究提示H19與OA軟骨細胞代謝間存在密切相關，可作為一個反映軟骨細胞代謝水平的標志物。

2.2 MEG3母系表達基因3(MEG3) MEG3是一個印記基因，在人類染色體上定位于14q32.3，是一個常見的lncRNA，具有腫瘤抑制作用，可編碼一段大小約為1.6kb的lncRNA，廣泛表達在正常組織中，而在腫瘤中出現明顯的表達缺失，可通過抑制多種腫瘤血管形成，從而達到抑癌的效應[27]。有研究表明，MEG3骨關節疾病發生發展有關。劉振峰等[28]研究顯示，lncRNA MEG3在OA軟骨組織中的表達明顯低于在正常軟骨組織表達，且隨著軟骨退化程度加大，lncRNA MEG3表達量降低，OA軟骨組織中VEGF的mRNA及蛋白表達均顯著高于在正常軟骨組織表達，VEGF的表達可隨著軟骨退化程度加大而有明顯增加，lncRNA MEG3和VEGF間的表達有負相關，提示lncRNA MEG可能通過對血管生成的調控，進而影響原發性OA發展進程。

2.3 lncRNA-CIR Liu等[29]通過高通量芯片分析OA軟骨細胞中差異表達的lncRNA，發現有152中lncRNA表達水平改變，發現lncRNA-CIR有異常表達，而lncRNA-CIR表達的變化與軟骨損傷有關，使用TNF-α及IL-1β處理后的軟骨細胞中lncRNA-CIR 表達升高，而抑制lncRNA-CIR的表達后，可促進蛋白聚糖及膠原形成，并能抑制MMP13和ADAMT55等細胞外基質降解酶表達，過表達lncRNA-CIR與之相反。Lu等[30]研究顯示，在OA患者中，lncRNA-CIR顯著上調表達，mir-130a下調表達和bim上調表達。生物信息學分析預測mir-130a是lncRNA-CIR和bim的靶基因，敲除lncRNA-CIR可明顯增加bim的表達，mir-130a顯著抑制了bim表達，同時細胞活性氧水平、炎性介質釋放、細胞凋亡和相對熒光素酶活性均明顯增加。Li等[31]研究顯示，lncRNA-CIR在OA患者中顯著上調表達，同時下調mir-27和上調MMP13表達。生物信息學分析預測，mir-27是lncRNA-CIR和MMP13的靶點，lncRNA-CIR過表達可明顯增加MMP13表達，而mir-27則顯著抑制了mmp13的表達，同時mRNA水平、蛋白質水平和相對熒光素酶活性的增加。提示lncRNA-CIR可能是OA診療的一個重要靶點。

2.4 生長停滯特異性轉錄本4(growth arrest-specific 5，GAS5) GAS5是一種可負性調節細胞生長的lncRNA分子，與糖皮質激素受體反應元素(GRE)有相似的結構，可與其競爭結合糖皮質激素受體，或抑制GRE下游基因，如凋亡相關的cIAP2表達，從而誘導細胞的凋亡[32]。在細胞缺乏生長因子及營養時，GAS5上調表達，當細胞處于饑餓狀態時，GAS5可調節GRE的活性，進而影響細胞生長及代謝[33]。Song等[34]研究顯示，GAS5在OA軟骨細胞中有明顯的上調表達，其高表達可促進金屬蛋白酶及蛋白聚糖酶ADAMTS-4表達，還可促進軟骨細胞凋亡及抑制自噬途徑，從而引起關節損傷。

3 lncRNA與類風濕關節炎(RA)

RA是一種慢性系統性自身免疫性疾病，以關節病變為主要特征，病理表現為間質有大量炎細胞浸潤、軟骨和骨組織的破壞、滑膜細胞持續增生等，其中慢性炎癥及滑膜關節的破壞是RA的主要主要的病理改變[35]。有研究表明，lncRNA參與自身免疫性疾病的調節[36]。有研究者通過對人血清及血單核細胞外泌體實驗分析，發現TUG1、LUST、SNHG4、MEG9等lncRNA在RA患者中的表達高于正常者，PRINS、PR反轉錄體、HOXA3as等lncRNA明顯下調表達[37]。多項研究也表明，lncRNA異常表達與RA發生發展密切相關。洪宏海等[38]研究顯示，RA患者滑膜組織中MT1JP的表達水平相對于正常組織降低，其表達水平的變化與血清中IL-6和IL-8等炎性因子水平呈現出負相關，MT1JP表達被抑制后，細胞中的這這些因子的分泌量增加，且p53表達受到抑制，提示MT1JP可能通過對p53表達的調控，進而促進炎性反應。Yang等[39]研究顯示，紫草素可降低RA小鼠軟組織和骨骼損傷，可顯著增強NR024118和SOCS3的表達，抑制IL-6、IL-8和MMPS的分泌和表達，且可減弱IL-1β對RA滑膜成纖維細胞的增殖影響，此外，紫草素可增加NR024118啟動子處的乙?；?，過表達NR024118或干擾NR024118表達均可改變SOCS3的表達，干擾NR024118表達后，可逆轉紫草素對MH7A細胞促炎因子、SOCS3和MMPS水平影響。對于RA的治療，一直以來都是醫學界的一個很大的難題，且對RA的治療也無明顯的的進展。以上研究提示在RA中lncRNA存在異常表達，這些研究可為免疫相關疾病的研究奠定了一定的基礎，提示這些lncRNA可能是RA診療的標志基因。

4 lncRNA與骨質疏松癥(OP)

OP是由于骨的形成與吸收不平衡，引起單位結構內骨量下降及骨的微結構被破壞，在參與OP代謝失衡動態平衡過程中，主要涉及到成骨細胞和破骨細胞等的分化調節，同時與骨代謝相關的信號途徑也發揮了重要的作用[40]。隨著中國OP患者年齡的逐漸增長，在該病的診斷及治療上要有突破和創新，近些年來，基因在OP中的作用受到廣泛關注。lncRNA在OP中的作用也有相關的報道。高艷等[41]研究顯示，BMP-2誘導C2C12成骨分化過程中，LncRNA AK051397在BMP-2誘導C2C12成骨分化中的表達升高，AK051397表達被抑制后，ALP、SP7表達降低，MYOG表達升高，提示在C2C12細胞中，LncRNAAK051397對成骨的分化有促進作用，對細胞成肌分化有抑制作用。BMPs是TGF-β家族成員之一，有多種亞型，BMPs/TGF-β信號途徑可通過Smad信號通路和p38信號通路調控BMMSc內Runx2基因表達，可調控BMMSc向成骨細胞分化，也可對成骨細胞分化和功能進行調節，進而在OP平衡中發揮重要作用[42,43]。Wei等[44]研究顯示，lncRNA HOTAIR可通過BMPs/TGF-β信號通路，調節miR-17-5p及靶基因Smad7表達，從而調節成骨細胞的增殖和分化。Zhang等[45]研究分析在BMMSc分化為成骨及破骨細胞過程中，lncRNA 表達譜及功能的變化，發現lncRNA xr-111050可通過調控MAPK信號途徑，調節BMMSc向成骨細胞或破骨細胞分化，可能成為骨再生及骨修復的一個靶點。以上的研究提示lncRNA在OP發病調控及治療中有重要作用，作為OP骨代謝的標志物，lncRNA對OP病理變化影響及對骨代謝相關信號通路的調控的方式，可為OP診療及預后判斷新的靶標。

5 lncRNA與炎癥通路調控機制

OA的主要病理表現為滑膜炎癥及軟骨的降解，近些年來，越來越多的lncRNA被確定為與調節炎癥信號通路有關，且在關節組織中呈現表達。目前lncRNA與OA相關的炎癥型號通路間關系并且完全明確，因此，確定lncRNA對OA中信號通路的調控作用，可能成為一個重要的治療方向。p38/MAPK信號通路、NF-κB信號通路、TLR信號通路和花生四烯酸途徑等是常見的炎癥信號途徑，且lncRNA與以上信號途徑間存在調控關系?，F就lncRNA與以上信號通路間的關系進行描述。

5.1 p38 MAPK信號通路 絲裂原活性蛋白激酶(MAPK)是一類重要的信號轉導通路，大多數細胞均有該信號途徑的存在，MAPK信號主要分布在細胞質，p38MAPK是一個MAPK家族的關鍵成員，在多種因素刺激作用下，如氧化應激、損傷等，p38可發生磷酸化，進而參與細胞生長、細胞凋亡、炎癥等過程[46,47]。目前為止，已有多項研究表明，OA進展與MAPK信號通路間存在密切關系。在OA患者研究中發現，MAPK信號在軟骨內被激活，與正常組織比較，c-Jun氨基端激酶及磷酸化的p38表達均有顯著的升高[48]。也有研究指出，MAPK信號在對軟骨細胞MMP分泌的調控過程中也發揮關鍵作用，在OA進程中，所產生的骨基質碎片，如纖連蛋白和膠原蛋白等，均可增強MMP在細胞中的分泌，此過程有MAPK信號的參與[49]。此外，多項研究表明，軟骨細胞凋亡與p38MAPK信號通路的調控有關，潘建科等[50]研究顯示，龍鱉膠囊可對p38及磷酸化的p38過量表達進行抑制，從而使p38MAPK在OA軟骨細胞中的活化受到抑制，從而對軟骨損傷有明顯改善作用。在OA模型的臨床研究中發現，使用p38抑制劑后，軟骨退變可明顯得到改善[51]。關于p38信號通路的lncRNA調控，目前的研究很少，有研究表明，lncRNA-MALAT1可調控p38MAPK信號，MALAT1是一個在非小細胞肺癌最早被發現的基因，在哺乳動物中有高度的保守性，提示MALAT1可能有重要的生物學功能，多項研究表明，MALAT1在多種腫瘤中有明顯的高表達，其過量表達對腫瘤生長有促進作用[52]。此外，也有研究表明，MALAT1與炎癥間有相關性，可通過活化內皮細胞SAA3，增加細胞IL-6分泌，誘導ROS的產生，增加細胞炎性反應[53]。

5.2 NF-κB信號通路 NF-κB是TFs家族成員，廣泛存在于真核細胞，是一種具有多項轉錄調節作用的蛋白因子，在大多數炎性反應及免疫應答過程中發揮重要作用。NF-κB的活化是一個復雜過程，當結合NF-κB的多個位點受到活化因素刺激后，NF-κB被激活，IκB被磷酸化，之后，IκB與NF-κB分離，NF-κB迅速進入核，而后發揮轉錄因子的功能，并誘導一些靶基因的表達，如cyclinD1、survivin等[54]。多項研究表明，OA損傷與NF-κB信號間存在相關性[55]。有研究顯示，有一定量的NF-κB在OA滑膜中存在，抑制NF-κB信號后，關節炎損傷程度可明顯得到改善[56]。有研究顯示，lncRNA-21低表達水平可增加RA患者中NF-κB的活性，甲氨碟呤(MTX)對RA患者有治療作用，lncRNA-21可抑制NF-κB信號，MTX可增加lncRNA-21的表達，進而抑制NF-κB信號途徑[57]。Trenkmann等[58]研究顯示，在RA滑膜成纖維細胞lncRNA HOTAIR表達明顯降低，HOTAIR的沉默與基質降解酶和NF-κB活性的上調有關，意味著抑制HOTAIR參與RA滑膜成纖維細胞生長。

5.3 TLR信號通路人類Toll樣受體(TLR) TLR是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，近些年來發現的一類細胞表面信號轉導跨膜受體，由三部分組成，即胞外和胞內結構域及跨跨膜區。作為一個固有免疫受體，TLR在T細胞、B細胞、自然殺傷細胞及樹突狀細胞等各種免疫細胞中有關廣泛的分布，隨著對TLR研究的深入，越來越多的研究表明，在非免疫細胞中也發現TLR的存在[59]。有研究顯示，在OA的滑膜成纖維細胞及軟骨細胞中均有TLR的表達[60]。Kim等[61]研究顯示，TLR2 的mRNA表達在所有的OA患者膝關節軟骨細胞樣本均可以檢測到，在OA患者樣本中的一半樣本也可檢測到TLR2的mRNA表達，同時檢測TLR在OA患者髖/膝關節軟骨水平，發現與正常軟骨及非損傷區TLR表達相比，TLR2和TLR4在軟骨損傷區的表達均有明顯升高，提示TLR2和TLR4在OA軟骨組織中表達增強。Toll受體可引起許多lncRNA表達，lncRNA-Cox2位于PTGS2基因附近，TLR2信號通路激活后可引起lncRNA-Cox2上調表達[62]。張飛飛等[63]研究顯示，Pam3CKS4可增強lncRNA NEAT1 NEAT1的表達水平，NEAT1的表達被抑制后能明顯部分降低TLR2信號活化所引起的趨化因子、細胞因子的表達，如CXCL10、CCL8及IL-6等，受NEAT1調節的基因均為TLR2持續緩慢誘導基因。

5.4 花生四烯酸(AA) 炎癥的調節及控制由炎性介質介導，AA是一類關鍵的可對炎癥介質進行調控的長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFAs)的衍生物[64]。AA代謝產物白三烯及前列腺素(PG)是炎性反應介質，在OA中存在差異表達[65]。在炎癥及疼痛治療方面，對AA途徑的靶向抑制是一直以來的一個極其重要的研究方面。環氧化酶(COX)是一個在AA代謝及PG和血栓素A2(TXA2)生物合成過程中的非常重要的限速酶，COX-2的選擇性抑制劑對OA癥狀有明顯改善作用[66]。有研究顯示，lncRNA PACER基因可控制COX-2基因開或者關，COX-2基因的活躍程度與癌癥、炎癥等均存在密切關系[67]。PACER基因可阻斷p50結合，增強COX-2活性。研究顯示，PACER在非OA軟骨及膝關節OA和髖關節OA中存在差異表達[68]。

6 結語及展望

隨著對lncRNA研究的深入，lncRNA在細胞內的作用已受到廣泛的關注。越來越多的研究證實lncRNA是一個可在轉錄、翻譯及染色質修飾等多個方面對基因表達調控的重要分子。目前研究仍發現一些lncRNA與骨關節疾病發生發展密切相關?？偟膩碚f，目前的研究揭示了少部分的lncRNA與骨關節疾病進展存在相關性，但lncRNA在OA中的作用仍存在一些亟待解決的問題。如在OA發病過程中，有哪些差異表達的lncRNA，且這些lncRNA是否在骨的破壞中有重要作用，且具體機制是什么，尚未明確；基因芯片已證實一些lncRNA與骨關節疾病進展密切相關，但哪些lncRNA起在OA進展中起到主導作用，以及對其的作用的調控機制如何，尚無明確的定論；在OA進展及軟骨分化過程中，可以有目的性的選擇哪些lncRNA進行干預，從而達到對軟骨損傷修復改善的目的。因此，對lncRNA在骨關節疾病中的作用，還需做進一步深入的探究。