基于網絡藥理學探討白芍治療原發性干燥綜合征的作用機制

屈祥科，陶慶文，孫建榮，王建明★

（1.北京中醫藥大學 研究生院，北京 100029；2.中日友好醫院 中醫風濕病科，北京 100029；3.免疫炎性疾病北京市重點實驗室，北京 100029）

原發性干燥綜合征 （primary Sjogren’s syndrome，pSS）是一種主要累及外分泌腺的慢性炎癥性免疫病，被認為是類風濕關節炎之后最廣泛的自身免疫病[1，2]，屬于中醫“燥痹”的范疇，中醫藥治療具有較好的療效。白芍是治療pSS 的常用中藥，具有抗氧化、調節免疫系統的作用，但存在分子機制不明確的問題，需進一步的探索?；诖?，本研究擬采用網絡藥理學分析白芍治療pSS 的潛在機制，以期為臨床應用和研究提供依據。

1 方法

1.1 白芍活性成分及作用靶點篩選

通過中藥系統藥理學分析平臺[3]（TCMSP）檢索白芍的活性成分，以口服生物利用度 （OB）≥30%和藥物相似性（DL）≥0.18 作為篩選條件，篩選出有效活性成分，并收集相關成分的作用靶點，通過Swiss Target Prediction 數據庫補充未知成分的靶點[4]，使用Uniprot 數據庫規范靶點名稱。

1.2 pSS 相關靶點篩選

以Sjogren’s syndrome、primary Sjogren’s syndrome 為 關鍵詞 在GeneCards、TTD 數 據 庫、DRUGBANK 數據庫進行檢索，剔除假陽性基因，合并3 個數據庫靶點，刪除重復值獲得pSS 相關靶點。

1.3 白芍成分- pSS 異常靶點PPI 網絡構建

利用R 軟件venn.diagram 包將白芍成分靶點與干燥綜合征相關靶點取交集獲得共有靶點。將所得靶點上傳至STRING11.0 數據庫構建蛋白互作（PPI）網絡模型[5]。生物種類設定為“Homo sapiens”，最小互相體用閾值設定為＞0.4，其余設置均為默認。得到PPI 網絡后，運用CytoScape 3.7.1 軟件對PPI 網絡進行可視化分析。

1.4 靶點功能與通路的富集分析

將藥物疾病靶點上傳至Metascape 數據庫[6]進行GO 富集和KEGG 通路分析，以P＜0.01 進行靶基因篩選，選取P 值前10 的GO 富集條目以及前20 的KEGG 通路條目，進行可視化展示。

1.5 藥物-成分-靶點-通路網絡構建

運用CytoScape3.7.1 構建藥物-成分-靶點-通路網絡圖，利用內置工具Network Analyzer 分析有效成分及靶點的網絡特征參數，包括網絡連接度 （Degree）、 介度 （Betweenness） 及緊密度（Closenesss）等，并根據網絡分析參數篩選核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

2 結果

2.1 白芍治療pSS 活性成分及潛在靶點

最終獲得芍藥新苷、芍藥苷、β-谷甾醇、谷甾醇、山奈酚等12 個活性成分。通過TCMSP 數據庫和Swiss Target Prediction 數據庫中獲得白芍作用靶 點174 個；GeenCards、TTD、DRUGBANK 數 據庫得到1015 個pSS 相關靶點。利用R 軟件，得到52 個白芍治療pSS 的潛在靶點。

2.2 PPI 網絡分析

將潛在靶點提交至STRING11.0 數據庫，得到PPI 網絡，運用CytoScape 3.7.1 軟件對PPI 網絡進行可視化分析，見圖1。

圖1 白芍治療pSS 相關靶點的PPI 網絡

2.3 靶點功能與通路的富集分析

通過Metascape 數據庫對52 個潛在靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路分析，以P＜0.01 為篩選標準。GO 富集分析得到1090 個生物過程，50 個細胞組成，78 個分子功能，主要涉及活性氧代謝、氧化應激反應、細胞遷移、細胞外基質等過程和功能，見圖2。

圖2 白芍活性成分靶點GO 富集分析

KEGG 分析共得到110 條相關通路，包括TNF 信號通路、細胞凋亡通路、IL-17 通路、HIF-1通路、鈣信號通路等經典通路，顯著性較高的20條通路見圖3。

圖3 白芍活性成分靶點KEGG 通路分析

2.4 藥物-成分-靶點-通路網絡構建

利用Cytoscape3.7.1 構建藥物-成分-靶點-通路網絡關系圖，并進行網絡連接度分析，在藥物-成分-靶點-通路網絡中，山奈酚連接度為28，預測山奈酚為白芍治療pSS 的主要成分，β-谷甾醇、芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥新苷亦是白芍治療pSS 的重要有效成分。AKT1 和MAPK8 在網絡中連接度均為17，而在緊密度和連接度上，MAPK8低于AKT1，提示AKT1 和MAPK8 可能是白芍治療pSS 的主要靶點。

3 討論

3.1 白芍通過多成分、多靶點、多通路發揮治療作用

白芍性涼，歸肝經、脾經，具有養血調經、收汗斂陰、平抑肝陽的功效，可改善口、眼干等癥狀，常用于治療陰液虧虛型pSS。本研究共篩選出白芍的12 個活性成分 （10 個活性成分涉及pSS 相關靶點），包括山奈酚、β-谷甾醇、芍藥內酯苷、芍藥新苷等，涉及52 個作用靶點，涉及通過TNF、IL-17、Toll 樣受體等炎癥信號通路，體現了白芍通過多成分、多靶點、多通路發揮治療作用的特點。

3.2 AKT 和MAPK8 可能是白芍治療pSS 的主要靶點

在pSS 的發生發展中，AKT、MAPK8 具有較為重要的作用。AKT 是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K 下游的主要效應物，共同構成PI3K/AKT這一經典的信號通路，具有調控細胞代謝、炎癥反應、蛋白質合成等功能。IL-17 在pSS 患者中高表達，通過PI3K/AKT 途徑上調人涎腺細胞中IL-6的分泌，介導外分泌腺體炎癥的發生，且與pSS 的病情嚴重程度相關[7]。有絲分裂原活化蛋白激酶8（MAPK8），又被稱為c-Jun氨基末端激酶1（JNK1），是MAPK 信號通路JNK 途徑的關鍵分子，對細胞增殖、炎癥反應等生理病理過程具有重要的調控作用。而JNK 級聯在涎腺浸潤CD4+T細胞和CD8+T 細胞的中被炎癥因子激活，參與pSS 的慢性涎腺炎發生[8]。

Cytoscape 和PPI網絡分析表明，AKT1、MAPK8 是白芍治療pSS 的主要靶點，山奈酚、芍藥苷是治療的重要活性成分。現代研究[9]發現，山柰酚具有較強的抗氧化作用，可影響PI3K、MAPK等蛋白激酶的磷酸化，降低通路活性，還可降低炎性因子（IL-1β、TNF-α）分泌水平，發揮抗炎作用。芍藥苷可調節免疫細胞的功能和激活，減少炎癥介質的產生，并恢復異常信號通路，抑制PI3K 和mTOR 的表達，抑制AKT 的磷酸化，減少B 淋巴細胞的增殖，抑制IL-17A、IL-6 等炎性因子的分泌和傳導，延緩外分泌腺體的炎癥進展，改善口眼干癥狀[10]。

限于網絡藥理學方法論的局限性和藥物成分在煎煮時和人體代謝反應的復雜性，本研究僅基于白芍的藥物成分進行網絡藥理分析，仍需要進一步的動物-細胞實驗驗證。