藥物性肝損傷有害結局路徑研究進展

彭 輝，張 麗，何 俊，梁 佳，郭家彬

（解放軍疾病預防控制中心，北京 100071）

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是由各類化學藥物、生物制劑、傳統中藥或其代謝產物等所引起的不同程度的肝損傷，可表現為膽汁淤積、肝脂肪變性和纖維化等多種臨床癥狀，嚴重的可導致肝衰竭甚至死亡[1-2]。DILI是臨床最為常見的一類肝損傷，如對乙酰氨基酚是一種廣泛使用的非處方解熱鎮痛藥，但其過量使用已成為臨床急性肝功能衰竭的主要原因之一。美國LiverTox網站（http：//www.livertox.nih.gov）最新收錄的可引起肝損傷的藥物達1000多種[3]，最近更新的藥物還包括用于治療新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的藥物、單克隆抗體和疫苗，如洛匹那韋、利托那韋、干擾素α和糖皮質激素等。潛在的肝損傷已成為藥物研發失敗或已上市藥物撤市的主要原因[4-6]，受到藥物研發和相關監管機構的高度重視。

2010年，美國環境保護署Ankley等[7]首次提出了有害結局路徑（adverse outcome pathway，AOP）的概念。AOP是把已知的1個分子起始事件（molecular initiating event，MIE）通過一系列的關鍵事件（key event，KE）與在生物不同組織層次所出現的有害結局（adverse outcome，AO）聯系起來[8-9]。AOP整合了體內外實驗、計算機模擬和臨床等各種相關信息，為化學物毒性評價和風險評估提供有用信息和實用工具。

AOP的核心內容是從分子、細胞、組織、器官、最終個體與群體水平將化學物與MIE和一系列與之相關的KE以及最終AO串聯起來，強調用邏輯推理確定這些KE之間的因果關聯。2013年，經濟合作與發展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）發布了AOP指南，2014年又發布了“AOP知識庫”（AOP Knowledge Base，AOP-KB），用于促進國際研究者對AOP研究的統一協作，不斷建立和完善更多的AOP及大力推廣應用。目前AOP-KB（https：//aopkb.oecd.org）包含5個模塊：2個知識庫（AOP Wiki和Effectopedia）及3個研發工具（AOPXplorer，AOP-DB 和 Intermediate Effects Database），所有模塊可通過入口協議（e.AOP.Protal）實現數據分享、交流和同步。本文介紹AOP的內涵和基本框架，重點綜述肝損傷相關AOP的構建和研究進展。

1 AOP的內涵及基本框架

AOP是模塊化的框架，它從MIE開始，即初始化學物質與生物分子發生作用（如受體/配體相互作用），然后經過細胞或器官等層面的一系列機體反應（如蛋白合成和穩態失衡等），最后到達毒性評價研究者所關注的AO（如發育受阻和癌癥等）[7]。

1個AOP由4個基本信息模塊組成，包括MIE、KE、關鍵事件關系（key event relationship，KER）和AO。MIE是外界刺激與生物分子的初始相互作用，是啟動KE的起始點。KE被認為是引起特定AO不可缺少的重要部分，本質上是一類可檢測可度量的生物學反應，如分子或細胞層面的受體-配體結合和基因激活等。KER通過描述上游KE與下游KE兩者的邏輯因果關系，將眾多的KE串聯成線；同時，KER代表2個KE之間的機械、結構或功能的關系，從提供劑量-反應的經驗數據中進一步得到驗證支持。AO可理解為導致細胞或有機體、系統或亞種群的功能損害，可以表現為形態學、生理學的變化，也可理解為毒性測試終點[7]。AOP的構建是個動態變化過程，隨新知識的出現而不斷更新完善。截止2021年8月，AOP-KB中已登記了300多個AOP項目和近1500個KE，但絕大部分AOP項目都尚在進一步研發完善中。

2 肝損傷AOP的構建

近年來，全球研究者們構建了一系列與肝損傷相關的AOP。通過AOP-KB網站查詢可知，截至2021年8月，知識庫收錄的與肝損傷相關的AOP已有25個。從MIE來看，它們包含了抑制膽汁鹽輸出泵、蛋白質烷基化、線粒體呼吸鏈完整性受損和激活多種炎癥信號通路等；從AO來看，包含了膽汁淤積、脂肪變性、肝纖維化和肝癌等；從OECD認可狀態來看，大部分AOP項目仍在開發中，少部分正在接受分子篩選和毒物基因組學專家咨詢組（Expert Advisory Group on Molecular Screening and Toxicogenomics）審查，或已被危害評估工作組（Task Force on Hazard Assessment）和測試指南計劃國家協調員工作組（Working Group of the National Coordinators for the Test Guidelines Programme）認可（表1）。Khadka等[10]研究表明，大部分DILI都可以利用AOP-KB中肝損傷相關AOP進行認識和評估。以下分別從肝損傷相關AOP的MIE、KE和AO等方面介紹DILI相關AOP的構建。

表1 有害結局路徑知識庫（AOP-KB）中與肝損傷相關的AOP

2.1 分子起始事件

AOP框架的1個關鍵特征是其無化學特異性，即1個AOP不特定于1個化學物質，可用于描述一組具有相同化學特性物質的潛在毒性作用[11]。對化合物結構的分析有助于描述化合物與特定的生物靶點之間產生的相互作用，即化合物所引起的MIE。結構上相似的化合物會表現出類似的有害效應，Hewitt等[12]對900多種藥物的化學結構數據進行分析，發現了16種具有潛在肝毒性風險的化學結構，并據此提出了這些結構可能成為DILI的MIE。通過定量構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）方法證明，某種化學物質如具有與雜環碳原子結合而形成酯鍵或在碳環體系上連有至少1個芳環，那么就會對膽汁鹽輸出泵產生抑制[13]，這也就是膽汁鹽輸出泵抑制介導的膽汁淤積型肝損傷（AOP-KB ID：27）中的MIE。肝X受體（liver X receptor，LXR）激活介導的肝脂肪變性（AOPKB ID：34）AOP的MIE是LXR的激活，對LXR的配體進行二維和三維QSAR研究顯示，化學物質中的苯環、氯基團和甲基決定了能否與LXR結合和活性的大小[13]。近期，由二維和三維QSAR技術構建的MIE計算機模型[14-15]，已被納入基于機械的評估暴露-反應關系的毒物代謝動力學/毒物效應動力學模型中[16]。

2.2 關鍵事件

肝損傷機制十分復雜，有研究表明，DILI涉及代謝酶系或轉運蛋白功能異常、膽汁淤積和膽小管損傷、炎癥反應、氧化應激、線粒體損傷和自身免疫反應等多種機制[17-18]。肝損傷的發病機制與化學物自身的化學性質（如親脂性、生物轉化）密切相關，如活性代謝產物與宿主蛋白共價結合并引起氧化應激，激活多種炎癥信號通路，誘發線粒體和內質網等細胞器應激，干擾膽汁酸轉運；結局是誘導抗氧化反應、內質網非折疊蛋白反應以及線粒體生物合成等適應性應答，避免發生嚴重肝損傷；嚴重結局是導致肝細胞壞死和凋亡等致死性后果[19-20]。

2.2.1 代謝酶功能異常

細胞色素P450酶作為機體內主要的代謝酶，它可通過Ⅰ相代謝反應將化合物代謝為水溶性極低的物質，并作為Ⅱ相代謝反應的底物，進一步通過葡萄糖醛酸化或硫酸化進行代謝[21]，部分化學物經代謝激活形成反應性代謝物引起肝損傷。越來越多的研究認為，化合物通過細胞毒性和持續的增殖作用模式導致機體產生癌癥[22]。在細胞色素P450家族2第E組成員1（cytochrome P450 proteins 2E1，CYP2E1）激活介導的肝癌（AOP-KB ID：220）AOP中，CYP2E1長期激活是這個AOP的MIE。CYP2E1可活化對乙酰氨基酚等多種底物，產生親電子代謝物。CYP2E1催化循環中易發生解偶聯，生成活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起氧化應激，底物單氧化產生反應性代謝物。ROS和代謝物都會引起肝細胞毒性，受損肝細胞通過增加細胞增殖進行自我修復。在CYP2E1長期慢性激活條件下，ROS和細胞死亡的持續增加和受損肝細胞的持續細胞增殖，導致肝癌發生。另外，藥物代謝酶系、跨膜轉運蛋白和溶質轉運蛋白等的基因多態性可導致肝代謝或轉運蛋白功能異常[19]，這些基因多態性及其表觀遺傳特點可增加宿主對DILI的易感性[23]。

2.2.2 線粒體損傷

線粒體是許多DILI的首要作用靶位。某些藥物本身和（或）其代謝物可以抑制線粒體呼吸鏈，造成ATP的消耗并且產生大量ROS，抑制β-氧化，造成脂肪變性[21]。在線粒體呼吸鏈復合物抑制介導的肝損傷（AOP-KB ID：273）AOP中，線粒體呼吸鏈復合物（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ）部分或完全受到抑制，可引起線粒體氧化磷酸化減少、ROS生成增多，壓力達到閾值后，觸發細胞凋亡或壞死，最終導致肝損傷。破壞線粒體結構穩定的KE也會進一步導致肝損傷，在內吞溶酶體攝取介導的肝纖維化（AOP-KB ID：144）AOP中，化學物質被細胞吸收后被轉運到溶酶體中，導致溶酶體腫脹，溶酶體的破壞引起了線粒體功能障礙、促凋亡蛋白的釋放，溶酶體將組織蛋白酶釋放到細胞質中觸發線粒體介導的細胞死亡，促炎介質產生增加并進一步激活白細胞，引起膠原蛋白積聚，最終導致肝纖維化。另外，一些藥物（如環丙沙星和他克林）可通過抑制肝線粒體DNA（mtDNA）復制、誘導mtDNA耗竭、觸發線粒體核酸酶的降解以及改變mtDNA甲基化狀態，引起mtDNA穩態的嚴重損害，誘導線粒體功能障礙，導致肝功能衰竭和死亡[24]。

2.2.3 炎癥反應的激活

炎癥反應的激活導致腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多種細胞因子的釋放，進而刺激TNF受體，導致相關炎癥通路激活，引起級聯反應。在IκB激酶（IκB kinase，IKK）復合物抑制介導的肝損傷（AOP-KB ID：278）AOP中，當IKK復合物被化合物抑制時，在炎癥反應中發揮關鍵作用的NF-κB通路的激活受到抑制，導致抗凋亡基因的轉錄減少；在細胞凋亡保護機制減弱的情況下，促凋亡的胱天蛋白酶8通路被激活，胱天蛋白酶8繼續激活胱天蛋白酶3，導致細胞凋亡或細胞死亡。細胞死亡增多進一步激活肝Kuppfer細胞，進而導致促炎介質（如TNF-α）增加，進一步加強了NF-κB通路的抑制，形成正反饋通路。通過級聯放大反應，最終引起組織壞死，導致肝損傷。另外，在絲氨酸/蘇氨酸激酶2（serine/threonine kinase 2，AKT2）激活介導的肝脂肪變性（AOP-KB ID：62）AOP中，化合物引起的炎癥反應導致Akt2的激活，進而增加甾醇反應元件結合蛋白的表達，最終導致肝脂肪變性。

2.2.4 免疫細胞活化

目前許多研究表明，機體免疫是化學物引起肝損傷的主要誘因，藥物或其代謝產物與蛋白質共價結合形成復合物，進一步形成能被T淋巴細胞識別的藥物或其代謝產物-肽復合物，激發淋巴細胞誘發免疫反應[25]。有人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）遺傳背景的患者，體內固有免疫激活提供的共刺激信號和藥物半抗原與宿主蛋白形成的加合物，可激活HLA限制性適應性免疫應答，從而引發特異質型DILI[20]。在免疫介導的肝炎（AOP-KB ID：362）AOP中，化合物引起機體產生苯醌亞胺和酰基葡糖苷酸代謝物等反應性代謝產物，反應性代謝物與蛋白質結合并充當抗原，與抗原呈遞細胞相互作用引起B和T細胞等免疫細胞活化，導致干擾素γ表達增加這一先天性和適應性免疫反應的表征，進一步導致炎癥和凋亡增加，最終引起免疫介導的肝炎。

2.3 有害結局

2.3.1 肝纖維化

肝纖維化是肝細胞損傷過程中的可逆性愈合反應，是肝修復和瘢痕形成之間的平衡過渡反應[26]，許多藥物（如甲氨蝶呤）可引起這一機體反應。肝星狀細胞的活化是引起肝纖維化的關鍵因素，過程分為初始階段和持續階段。在初始階段，ROS或瀕死細胞所產生的凋亡小體使處于休眠狀態下的星狀細胞開始對生長因子變得敏感。在持續階段，活化的星狀細胞經過增殖、皺縮、纖維化、趨化、胞外基質降解和類視黃醇缺失等變化過程，呈現出纖維細胞樣表型[26]。

蛋白烷基化介導的肝纖維化（AOP-KB ID：38）[27]這一AOP是肝纖維化產生的典型AOP，它描述了蛋白質烷基化引起的肝損傷與肝纖維化形成之間的聯系（圖1）。MIE是蛋白質烷基化，它引起肝細胞結構和功能的損傷，并進一步導致細胞死亡，隨后肝細胞出現DNA片段化并形成凋亡小體，凋亡小體被吞噬后，Kupffer細胞被激活。轉化生長因子 β（1transforming growth factor-β1，TGF-β1）是最有效的促纖維化細胞因子，它是活化的Kupffer細胞的主要產物。TGF-β1表達增多進一步引起肝星狀細胞的活化，這也意味著細胞向具有增殖性和收縮性肌成纖維細胞（肝纖維化中的中樞效應子）分化。活化的肝星狀細胞引起進行性膠原蛋白積聚，改變了細胞外基質的組成。細胞外基質蛋白的過度積累逐漸影響整個肝器官，改變了肝的正常功能，最終引起肝纖維化。

圖1 蛋白烷基化介導的肝纖維化的AOP流程圖[27].TGF-β1：轉化生長因子β1.

2.3.2 脂肪變性

肝脂肪變性是化合物誘導肝損傷的典型表現，它是肝細胞內脂質（主要是甘油三酯）的異常蓄積過程，表現為甘油三酯的合成及分解異常，引起肝脂質體內平衡擾動[28]，許多藥物（如丙戊酸）可引起這一機體反應。脂肪變性可進一步發展成非酒精性脂肪性肝炎，其特征是肝細胞損傷和炎癥反應。脂肪變性分為微囊型脂肪變和大泡型脂肪變。在微囊型脂肪變中，肝細胞的胞質中會形成許多小脂滴，但不會影響細胞核位置；而在大泡型脂肪變中，細胞核則被較大的脂滴擠于一側。

導致肝脂肪變性的分子機制有很多，涉及到多個不同通路，化合物與核受體之間的相互作用是導致脂肪變性的常見機制。圖2為LXR激活介導的肝脂肪變性（AOP-KB ID：34）的AOP流程圖[29]。LXR是核受體家族中的一員，屬于配體依賴型轉錄因子，在脂代謝中具有重要的調節作用。MIE是LXR的激活，它可引起大量相關基因的轉錄改變，包括碳水化合物反應元件結合蛋白、甾醇反應元件結合蛋白1c、脂肪酸合成酶以及硬脂酰輔酶A去飽和酶1等相關表達的激活，進一步引起肝細胞內脂肪酸合成增強[30]。同時LXR的激活引起游離脂肪酸攝取轉運蛋白CD36表達升高，促使脂肪酸從周圍組織向肝流入。這兩方面都導致了甘油三酯聚集這一KE，細胞器水平表現為細胞質的位移、細胞核變性扭曲、線粒體破壞和內質網應激，并最終導致細胞層面的脂肪肝細胞出現，以及組織效應層面臨床上的脂肪肝（脂肪變性和肝增重5%～10%）。

圖2 肝X受體（LXR）激活介導的肝脂肪變性的AOP流程圖[29].ChREBP：碳水化合物反應元件結合蛋白；SREBP-1c：甾醇反應元件結合蛋白1c；FAS：脂肪酸合成酶；SCD1：硬脂酰輔酶A去飽和酶1；CD36：脂肪酸受體36.

2.3.3 膽汁淤積

膽汁淤積是指機體膽汁分泌受損的各種情況，伴隨著潛在的有害嗜膽汁菌在肝或體循環中的積聚，膽汁淤積發生率在DILI病例報告中高達47%[31]，許多藥物（如波生坦）可引起這一機體反應。在膽汁鹽輸出泵抑制介導的膽汁淤積型肝損傷（AOPKB ID：27）AOP[32]中，MIE是膽鹽輸出泵的抑制，進而導致膽汁酸在肝細胞和膽小管中的蓄積，機體隨之產生適應性反應和病變[5]。病變的發生在細胞層面表現為線粒體通透孔的形成，造成線粒體損傷、ROS生成以及炎癥反應這些KE，最終通過調亡和壞死致細胞死亡[32-33]。

膽汁淤積也會使細胞產生適應性反應，這是細胞為抵消膽汁蓄積的不良影響從而防止肝損傷而產生的自發保護反應。膽汁酸活化核受體后，通過一系列復雜的轉錄協調機制，使肝細胞中膽汁酸和膽紅素攝取減少、排出增多，并增加膽汁酸代謝、減少膽汁酸合成。肝細胞為緩解膽紅素蓄積而產生的一系列效應，可引起膽紅素尿和高膽紅素血癥，皮膚以及鞏膜產生黃色素沉積進而形成黃疸。

2.3.4 肝癌

慢性肝病可能會發展為肝癌，尤其是肝細胞癌。目前AOP-KB中與肝癌相關的AOP已有4個，它們分別起始于不同的MIE，即抑制誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）（AOP-KB ID：32）、激活過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPAR-α）（AOP-KB ID：37）、調節芳香烴受體（AOPKB ID：41）和激活CYP2E1（AOP-KB ID：220）。其中抑制iNOS或激活CYP2E1這2種MIE如果持續發生，通常會引起肝毒性并促進肝癌發生[34]。這4個AOP共享許多與破壞肝穩態平衡以促進癌細胞生長相關的KE，包括細胞增殖增加、多種肝細胞類型的增生以及腫瘤前病灶細胞的克隆擴增等。這些KE可通過許多機體中間效應事件來促進，如氧化應激、NF-κB激活和間隙連接細胞間通訊抑制等[34]。最近，從DNA加合物形成到肝血管肉瘤發生的AOP也被添加到AOP-KB（ID：240）中。

3 肝損傷AOP的發展

隨著AOP理念在毒理學研究者中的廣泛接受和積極實踐，為藥物毒性評價、化學品毒性篩查、環境污染物暴露評估提供新思路和方案的AOP策略同時面臨新的問題和挑戰。伴隨各種組學技術、計算毒理學和大數據分析等技術的飛速發展，AOP在理念創新、模型驗證、新技術引進等方面取得了一定發展，以下分別從AOP網絡和定量AOP介紹DILI相關AOP的發展趨勢。

3.1 AOP網絡的構建

當前對AOP這一毒性測試策略的質疑主要集中在它的簡易性和對復雜毒理學過程（包含適應性反應和自我修飾）描述的不充分性。確實，AOP描述的是獨立線性事件，然而機體內真實的機制并非如此簡單，而且不同的通路可能平行存在或互相串聯交流[13]。AOP網絡這一新理念應運而生，它將一組共享相同KE的多個單線性AOP串聯結合，可更好地描述機體內復雜的生物過程[35-36]。近幾年，已有研究者通過構建AOP網絡開展毒性機制研究，如研究肝脂肪變性的AOP網絡[37]和對導致線粒體功能障礙機制研究的AOP網絡[38]等。從LXR激活介導的肝脂肪變性（AOP-KB ID：34）的原始AOP的流程圖[29]上還可見AOP網絡中相關聯的其他5個AOP的大體構成，充分體現了AOP的模塊化單元式結構以及KE和KER的通用性和共享性。此外，將拓撲學特征應用在AOP網絡的開發研究也取得了相應進展，如自動識別AOP網絡中最常見路徑的緊密連接程度等[39-40]。

3.2 定量AOP的發展

隨著AOP優化完善相關研究的開展，AOP的量化工作漸漸引起大家的關注。定量AOP（quantitative AOP，qAOP）已被認為是定量化學品毒性風險評估的重要工具[41-42]，它能解決評價上游KE達到何種擾動程度才能引起下游KE的變化，以及在何種條件下可能發生AO這一棘手問題[43]。qAOP在普通AOP構建的基礎上，進一步考慮了KER的量化、數據可用性、定義誘導效應的閾值、KER數學規則的建立、非線性模型的參數化以及模型驗證等問題[44-45]。

qAOP從定性AOP發展而來，它通過數學或統計函數f（x）量化了KER。f（x）可以是簡單的數學方程，也可以是復雜的基于生物學的計算模型，這些模型考慮了其他生物學調節因素，如補償性反應或與其他生物或環境變量的相互作用[11]。基于從暴露模型得到的環境暴露量的預測值、毒代動力學得到的受試物的內在暴露值，通過對KER的量化，對激活MIE的外部或內部的化學物質濃度進行范圍限定，進而推斷AO的發生幅度或概率，可建立用于風險評估的劑量反應模型（圖3）[11]。

圖3 定量AOP模型在風險評估中的應用[11].f（x）：數學或統計函數.

qAOP模型可以將KER中復雜的反饋回路、閾值或級聯信號進行合并，與具有簡化假設的模型相比，包含復雜生物關系的模型可以創建具有更高生物保真度的預測體系，以支持或開展更為準確的風險評估[43]。近兩年，通過建立基于概率的貝葉斯模型和基于機制的回歸模型進行qAOP研究，已經取得了較高的模型預測率和準確率[46-47]。雖然目前已有少量的AOP開展了定量研究，但絕大多數AOP（包括與肝損傷有關的AOP）仍是定性的[48]。

4 結語

在藥物早期發現和臨床前評價階段，準確評估受試藥物引起肝損傷仍然面臨很大的挑戰。在傳統的毒性測試中，采用動物實驗進行肝毒性篩選存在一定的滯后性和假陰/陽性，然而以人源細胞構建的體外測試模型則可檢測出高達60%具有肝毒性的化合物[13]。AOP能以一種更精確規范的方式整合各類數據，對化學物誘導DILI的潛在風險進行預測。AOP作為底層理論基礎可構成研究肝毒性的體外組合試驗（in vitrotest batteries），這一研究思路已在最近的肝脂肪變性研究中得到證實[49]。此外，基于數據挖掘、深度學習或AI機器學習等的智能算法技術，已被應用于推導MIE和KER以及構建AOP框架的研究中[50-52]，為加速AOP的構建提供了新的技術方法。這些研究和技術發展表明，AOP為DILI評估提供了強有力的工具。未來將建立更多與DILI密切的AOP，同時進一步完善現有的肝損傷相關AOP，并大力推動AOP在DILI評估中的應用。