HPLC-ELSD 法測(cè)定腎康寧顆粒中黃芪甲苷含量

龍白堅(jiān)，夏國(guó)漢，黃東，吳良發(fā)

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

腎康寧顆粒由黃芪、丹參等八味中藥組成，方中君藥為黃芪，黃芪甲苷為主要活性成分之一［1-3］，處方中含黃芪的制劑大多以黃芪甲苷作為含量檢測(cè)成分，目前未有關(guān)于測(cè)定腎康寧顆粒中黃芪甲苷含量的文獻(xiàn)報(bào)道。由于黃芪甲苷只在201 nm 波長(zhǎng)處有弱的紫外末端吸收，其它波長(zhǎng)無明顯的紫外吸收，選用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器方法或者薄層掃描法測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定［4-6］。參考相關(guān)文獻(xiàn)［7-14］，本文建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）法測(cè)定腎康寧顆粒中黃芪甲苷的含量，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確率高，可作為腎康寧顆粒質(zhì)量控制的技術(shù)手段之一。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀HPLC（型號(hào)：Agilent 1100），蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD（型號(hào)：Alltech-2000）。黃芪甲苷對(duì)照品（含量測(cè)定用）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110781-201314。乙腈為色譜純級(jí)，試驗(yàn)用水為超純水，其它試劑均為分析純。腎康寧顆粒：江西山高制藥有限公司（批號(hào)：20100101、20100201、20110501、20110502、20100504，規(guī)格：每袋5 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.4 mg 的溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

取樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取約12 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過。精密吸取續(xù)濾液25 mL，蒸干，加水50 mL 分次溶解殘?jiān)盟柡偷恼〈既芤赫駬u提取4 次，每次30 mL，合并正丁醇溶液，用氨試液反復(fù)洗滌2 次，每次50 mL，取正丁醇溶液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 陰性樣品溶液制備

除不加黃芪藥材外，取其他七味藥材按制法制成陰性樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液,即得。

2.4 色譜條件

以Diamonsil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）為色譜柱，柱溫設(shè)為30 ℃；以水-乙腈（65∶35）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min；ELSD 參數(shù)設(shè)置：漂移管溫度設(shè)為105 ℃，載氣流速設(shè)為2.5 L/min；進(jìn)樣量為10 μL。按上述色譜條件進(jìn)樣分析，待測(cè)成分分離效果好，測(cè)定色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品（A）、供試品（B）、陰性樣品（C）色譜圖

2.5 線性范圍

取對(duì)照品溶液適量，用甲醇配制成濃度依次為0.040 4、0.202、0.404、0.808、1.212 mg/mL 的系列對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μL 進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量（X）的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到線性方程lgY=1.315 9lgX+5.833 6，r=0.999 9。結(jié)果表明黃芪甲苷在0.404～12.12 μg 之間與峰面積呈良好的對(duì)數(shù)線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果峰面積RSD 為1.8%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品配制0，6，12，18，24 h 后精密吸取同一供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，結(jié)果測(cè)定峰面積RSD 為1.6%，表明供試品溶液在24 h 之內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定含量，結(jié)果平均含量為0.135 6 mg/g，RSD 為1.9%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（含量為0.135 6 mg/g），研細(xì)，取6 份，每份約6 g，精密稱定，加入濃度為0.016 16 mg/mL 的黃芪甲苷對(duì)照品甲醇溶液50 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備加標(biāo)溶液，按上述色譜條件，分別精密吸取10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.10 樣品測(cè)定

取5 批樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按上述色譜條件測(cè)定黃芪甲苷峰面積，采用回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 提取方法的考察

通過對(duì)不同提取方式（超聲、回流、振搖）、溶劑種類（甲醇、50%甲醇、水）和正丁醇振搖提取次數(shù)（1、2、3、4、5 次）等影響因素的考察，發(fā)現(xiàn)樣品用甲醇超聲處理30 min 后，再加正丁醇振搖提取4 次，氨試液洗滌2 次，色譜峰雜質(zhì)干擾較少，黃芪甲苷含量最高，故采用“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。

3.2 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件的考察

影響蒸發(fā)光散射檢測(cè)器信號(hào)響應(yīng)的主要因素是載氣流量和漂移管溫度，經(jīng)對(duì)載氣流量和漂移管溫度對(duì)基線和峰面積影響的考察，確定載氣流量為2.5 L/min、試驗(yàn)溫度為105 ℃時(shí)分離效果好，基線穩(wěn)定。

3.3 樣品測(cè)定結(jié)果分析

表2 表明不同批號(hào)的樣品黃芪甲苷含量有差異，腎康寧顆粒為獨(dú)家品種，樣品來源相同的前提下，批間差異可能是黃芪原藥材或者生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定造成的。因此，固定黃芪原藥材產(chǎn)地，保障藥材質(zhì)量和工藝穩(wěn)定性可以有效減少批間差異，提高藥品質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性。經(jīng)調(diào)研，黃芪甲苷在成品中的平均轉(zhuǎn)移率約為30%，《中國(guó)藥典》2020 年版一部規(guī)定黃芪中黃芪甲苷的含量不得低于0.080%，若按0.080%計(jì)算，則本品每袋含黃芪甲苷應(yīng)不少于0.43 mg，《中國(guó)藥典》2020 年版一部收載的腎康寧顆粒規(guī)定的黃芪甲苷含量限度偏低。