低碳水化合物飲食對(duì)小鼠腎臟和肝臟的影響

徐 容，曹入雙，楊 茂，林奉康，甘仲霖*

（1.西南醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)學(xué)研究所，四川瀘州 646000）

飲食是人類維持健康的一個(gè)強(qiáng)有力的決定因素[1]。已有大量研究證實(shí)，飲食中3大營養(yǎng)素的比例對(duì)人類的健康和壽命至關(guān)重要[2-4]。長期以來，中國居民傳統(tǒng)膳食結(jié)構(gòu)以碳水化合物為主，供能比約占60%～70%。自從美國醫(yī)生阿特金斯提出低碳水化合物飲食的概念以來[5]，低碳水化合物飲食或生酮飲食已成為廣為人知的減肥方法，該方法在人群中的應(yīng)用越來越廣泛[6-8]。

近年來，已有大量關(guān)于低碳水化合物飲食對(duì)機(jī)體減肥作用的研究[9-11]，有研究表明低碳水化合物飲食在機(jī)體減肥、降低膽固醇水平、降低心臟病風(fēng)險(xiǎn)等方面的有效作用[12-14]，但是低碳水化合物飲食對(duì)腎臟和肝臟的影響的研究較少。因此，研究低碳水化合物飲食對(duì)腎臟和肝臟的影響，尋找有益于健康的飲食結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)健康食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

體質(zhì)量為（20±2）g的雄性昆明小鼠32只，購于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（川）2018-17；所有動(dòng)物飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)室，實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號(hào)：SYXK（川）2018-065，溫 度22～26 ℃；相對(duì)濕度：30%～70%；人工照明12 h明暗交替，通風(fēng)良好。

1.1.2 飼料

普通飼料購于北京科澳協(xié)力飲食有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為京飼證（2018）06073。普通飼料原料包括玉米、豆粕、大豆、魚粉、面粉、酵母粉、植物油、葡萄糖、食鹽、多種維生素和礦物元素等。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[8,15]，以普通飼料為基礎(chǔ)，加入葡萄糖和大豆，改變普通飼料中碳水化合物的供能比，制作低碳飼料、中碳飼料和高碳飼料。4種碳水化合物飼料的供能比，如表1所示。

表1 4種碳水化合物飼料的供能比

1.1.3 試劑

肌酐（北京中昊公司，貨號(hào)：KB02-H1；規(guī)格：2×96 well plate）；尿素氮（上海吉至公司，貨號(hào)：BC1530，規(guī)格：50T）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（北京索萊寶公司，貨號(hào)：BC1550，規(guī)格：50管T）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（北京索萊寶公司，貨號(hào)：AKAM019C，規(guī)格：50 T））；膽堿酯酶（北京索萊寶公司，貨號(hào)：BC2025，規(guī)格：100 T））；果糖胺（北京江晨文軒公司，貨號(hào)：JL35194，規(guī)格：96 T）；蘇木精染液（Thermo公司，批號(hào)：7211，規(guī)格：500 mL）；伊紅染液（Thermo公司，批號(hào)：7111；規(guī)格：500 mL）。

1.1.4 儀器與設(shè)備

GA-3快速血糖儀；TP-213電子天平；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣）；ASP300S全密閉式自動(dòng)脫水機(jī)；RM2235切片機(jī)（徠卡公司）；攤片機(jī)（南京威美特）；CKX41S 倒置顯微鏡（OLYMPUS公司）；數(shù)字切片掃描儀（匈牙利公司）；低溫高速離心機(jī)（Thermo公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 飲食干預(yù)與動(dòng)物處理

將32只小鼠隨機(jī)分成普通飲食組，低碳飲食組、中碳飲食組和高碳飲食組，每組8只。每7 d監(jiān)測(cè)一次小鼠的體重和血糖，28 d后采用二氧化碳麻醉所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[16]，待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入深麻后采集全血，取出腎臟和肝臟，使用濾紙吸去臟器表面的血污，分別稱量腎臟和肝臟濕重并記錄，按照如下公式計(jì)算臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=臟器濕重（g）/小鼠體重（g）×100%。

1.2.2 ELISA試劑盒測(cè)定血清細(xì)胞因子

將全血在室溫靜置1 h后，使用離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，取出上清液即為血清[17]。準(zhǔn)確稱量血細(xì)胞和全血的重量，按照如下公式計(jì)算血細(xì)胞比容∶血細(xì)胞比容=血細(xì)胞重量（g）/全血重量（g）。按照試劑盒說明，分別檢測(cè)肌酐（Creatinine，Crea）、尿素氮（Urea nitrogen，UN）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、膽堿酯酶（Cholinesterase，CHE）和果糖胺的含量。

1.2.3 腎臟和肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

將腎臟從腎盂處對(duì)半切開，肝臟切成厚度大約為3～ 5 mm，大小為1.5～2 cm2的組織塊，制作腎臟和肝臟切片后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察腎臟和肝臟的形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有計(jì)量資料均運(yùn)用Excel 2019和SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以“X—±S”表示。重復(fù)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。組間比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD法，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 低碳飲食對(duì)小鼠體重和血糖的影響

飲食干預(yù)后，觀察低碳飲食對(duì)小鼠體重的影響，其結(jié)果如表2所示。時(shí)間的主體內(nèi)效應(yīng)檢驗(yàn)顯示p＜0.05，表明各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠體重存在差異。由表3可知，時(shí)間和飲食的主體內(nèi)效應(yīng)檢顯示p＞0.05，提示時(shí)間和飲食無交互作用。方差分析顯示p＞0.05，說明4種飲食所喂養(yǎng)小鼠的體重?zé)o顯著差異。

表2 低碳飲食對(duì)小鼠體重的影響

表3 低碳飲食對(duì)小鼠血糖的影響

2.2 低碳飲食對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

由方差齊性檢驗(yàn)可知，腎臟系數(shù)和肝臟系數(shù)的顯著性概率p值分別為0.55和0.966，表明方差齊性檢驗(yàn)通過。相比普通飲食組，低碳飲食組小鼠的腎臟系數(shù)和肝臟系數(shù)明顯增大（p＜0.05），中碳飲食組小鼠的腎臟系數(shù)和肝臟系數(shù)有下降的趨勢(shì)，但未見顯著性差異。相比中碳飲食組，低碳飲食組小鼠的腎臟系數(shù)和肝臟系數(shù)顯著增大（p＜0.001）,結(jié)果如表4所示。

表4 低碳飲食對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

2.3 低碳飲食對(duì)小鼠肝功和腎功的影響

由方差齊性檢驗(yàn)可知，Crea、UN、ALT、AST和CHE的顯著性概率p值分別為0.394、0.115、0.437、0.132和0.556，說明方差齊性檢驗(yàn)通過。相比普通飲食組，低碳飲食組小鼠的UN和AST顯著升高（p＜0.05）。相比中碳飲食組，低碳飲食組小鼠的UN、ALT、AST和CHE顯著升高（p＜0.05），結(jié)果如表5所示。

表5 低碳飲食對(duì)小鼠腎功和肝功的影響

2.4 低碳飲食對(duì)小鼠血細(xì)胞比容和果糖胺的影響

由方差齊性檢驗(yàn)可知，血細(xì)胞比容和果糖胺的顯著性概率p值分別為0.135和0.383，說明方差齊性檢驗(yàn)通過。相比中碳飲食組，低碳飲食組小鼠的血細(xì)胞比容明顯增大 （p＜0.05），結(jié)果如表6所示。

表6 低碳飲食對(duì)血細(xì)胞比容和果碳胺的影響

2.5 低碳飲食對(duì)小鼠腎組織和肝組織形態(tài)變化的影響

腎組織切片在400 x的光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果如圖1所示，相比普通飲食組，低碳飲食組小鼠的腎臟切片可見上皮細(xì)胞多腫脹壞死，少量上皮細(xì)胞脫落，細(xì)胞間隙不清，細(xì)胞核大小不一，染色較淺。中碳飲食組小鼠的腎臟切片可見腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，腎小球未見基底膜增厚和系膜細(xì)胞明顯增多。高碳飲食組小鼠的腎臟切片可見大量腎小管上皮細(xì)胞排列緊密，少量上皮細(xì)胞輕微腫脹，腎小球未見系膜細(xì)胞增多。

圖1 低碳飲食對(duì)小鼠腎組織形態(tài)變化的影響（HE，400 x）

肝組織切片在400 x光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果如圖2所示，相比普通飲食組，低碳飲食組小鼠的肝臟切片可見大量肝細(xì)胞發(fā)生空泡變性，肝血竇走向混亂，細(xì)胞輪廓難以觀察清楚，匯管區(qū)可見脫落的上皮細(xì)胞和少量膠體樣物質(zhì)。中碳飲食組小鼠的肝臟切片可見肝細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大小均一，細(xì)胞核輪廓比較清晰，肝血竇呈放射狀；高碳飲食組小鼠的肝臟切片可見部分肝細(xì)胞發(fā)生空泡變性，細(xì)胞間隙變大，肝血竇放射狀排列不明顯。

圖2 低碳飲食對(duì)小鼠肝組織形態(tài)變化的影響（HE，400 x）

3 討論與結(jié)論

碳水化合物是飲食中常見而重要的能量物質(zhì)[18]，在機(jī)體生長發(fā)育、維系健康、抵御疾病等方面具有非常重要的作用。醫(yī)學(xué)雜志《柳葉刀公共衛(wèi)生》中報(bào)道了一項(xiàng)歷經(jīng)25年的隊(duì)列研究，結(jié)果顯示低碳水化合物飲食（碳水化合物含量少于食物總體熱量的40%）和高碳水化合物飲食（碳水化合物含量超過食物總體熱量的70%）都會(huì)縮短壽命，食用適量碳水化合物的人比食用低碳水化合物的人長壽4年，比食用高碳水化合物的人長壽1年[19]。美國醫(yī)學(xué)研究所發(fā)布的可接受的宏量營養(yǎng)素分布范圍（AMDRs）建議，含45%～65%碳水化合物，10%～35%脂肪的飲食攝入，同時(shí)提供必需營養(yǎng)素?cái)z入，可以降低患慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[20]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比普通飲食組，中碳飲食組小鼠的腎臟系數(shù)、肝臟系數(shù)、UN、ALT和AST有下降趨勢(shì)但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高碳飲食組小鼠的腎臟系數(shù)、肝臟系數(shù)、UN、ALT和AST有升高趨勢(shì)但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與本次實(shí)驗(yàn)的研究周期不夠長有關(guān)。

不同水平碳水化合物飲食的供能比差距大，但機(jī)體仍然能夠維持體重和血糖的穩(wěn)定，表明了機(jī)體具有極強(qiáng)維持自身穩(wěn)態(tài)的能力。雖然機(jī)體維持了基本穩(wěn)態(tài)，但卻加重了機(jī)體相關(guān)臟器的代謝負(fù)擔(dān)，甚至損傷相關(guān)臟器。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相比普通飲食組和中碳飲食組，低碳飲食組小鼠的腎臟和肝臟出現(xiàn)了明顯的代償性肥大，腎臟功能和肝臟功能也出現(xiàn)了明顯下降，腎臟組織和肝組織形態(tài)損傷明顯。

紅細(xì)胞代謝不僅僅產(chǎn)生和運(yùn)輸氧氣和二氧化碳，還反映了機(jī)體的新陳代謝[21]。鄒寧等[22]研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)高原地區(qū)健康人群的血細(xì)胞比容高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的參考區(qū)間。趙敏等[23]多位研究者研究發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞比容與對(duì)比劑腎病存在正相關(guān)，這是由于對(duì)比劑進(jìn)入血管使血液流動(dòng)性減弱，供氧不足而造成局部組織缺氧，從而導(dǎo)致血液中聚集了大量血細(xì)胞。ISEKI K等[24]研究發(fā)現(xiàn)在貧血患者中，紅細(xì)胞壓積越低，患者發(fā)生終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)越大。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低碳飲食組小鼠的血細(xì)胞比容明顯高于中碳飲食組小鼠，這可能是低碳飲食組小鼠為了維持新陳代謝的穩(wěn)定，增加了血細(xì)胞數(shù)量以維持機(jī)體對(duì)能量和營養(yǎng)素的需要。在不合理的膳食結(jié)構(gòu)情況下，機(jī)體基本穩(wěn)態(tài)的維持以腎臟和肝臟的超負(fù)荷運(yùn)行為代價(jià)，低碳水化合物飲食會(huì)導(dǎo)致腎損傷和肝損傷。