基于CFD技術優化50 L發酵罐空氣分布器 實現馬克斯克魯維酵母高密度發酵

談亞麗，李 嘯,，張小龍，杜維力，熊 蓉

（1.湖北省酵母功能重點實驗室 湖北安琪生物集團有限公司，湖北宜昌 443003； 2.三峽大學 生物與制藥學院 中國輕工業酵母功能重點實驗室，湖北宜昌 443003）

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）因具有食品安全屬性，被原國家衛生和計劃生育委員會于2013年批準為新食品原料[1-2]。該菌種耐高溫、培養底物譜廣，可利用菊粉、乳清、木質纖維素等廉價原料；另外，自身酶系合成能力強，可產β-半乳糖苷酶、羰基還原酶等，因而被廣泛應用到工業生物技術、食品發酵等領域。

近年來，將具有產業化價值潛力的菌株投放到工業化規模生產，結合生產效率及成本因素，還必須實現菌體的高密度培養。高密度細胞培養技術（High Cell Density Culture，HCDC）是指通過優化培養基配方及發酵調控策略、改進反應器性能來提高菌體發酵密度，使菌體密度較傳統培養方式提高10倍以上，從而提高時空產率，減少設備投資，降低生產成本，提高產品市場競爭力。其中反應器的流場特性決定了細胞所處的外部環境，從物料和能量的供給上直接影響菌體的生長特性，因而對發酵效率的提升及優化具有重要影響。

計算流體力學（Computational Fluid Dynamics，CFD）是將流體動力學和數值計算方法緊密結合對流體的流動、傳熱和傳質過程進行分析的一門交叉學科。倪偉佳[3]等研究了不同攪拌槳葉組合下的流場情況，通過CFD數值模擬分析，優化了攪拌槳組合結構，提高了頭孢菌素C的發酵效率。侯洪國等[4]采用CFD研究了大型側攪拌發酵罐內流場情況，對比仿真分析結果，可以很好地描述攪拌槳對罐內流體的攪拌效果。由于通過CFD模擬計算可獲取反應器中整體和局部的氣含率、流體速度、湍動能等流體力學參數，從而較為直觀地反映出反應器內的流場特性，所以已逐漸成為生物反應器性能優化和設計的一個重要工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）NAQU Plateau KM-Ⅵ：由湖北安琪生物集團有限公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 種子培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrosemedium， YEPD）培養基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨1%。 108 ℃滅菌20 min。

1.1.3 分批補料發酵培養基

30%葡萄糖，10%磷酸二氫銨，15%氨水，0.5%酵母浸粉，0.3%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂。pH=5.2，115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

FUS-50 L型發酵罐（A、B、C 3個）：帶溶解氧傳感器（瑞士Hamilton 238633-1343），pH傳感器（梅特勒-托力多InPro3100/120 Pt1000），上海國強生化工程裝備有限公司；PAS7000型生物尾氣分析儀：重慶哈特曼科技有限公司；ZHWY-211D腳踏開門型大容量全溫度恒溫搖床：上海智城生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及種子液制備

將保藏于甘油管的馬克斯克魯維酵母菌株接入裝液量為20 mL/250 mL的YEPD培養基中進行初次復壯，30 ℃、180 r/min條件下，培養18 h。再將初次復壯后的菌液接入 2 L種子發酵培養基作為種子液，接種量10%，30 ℃、 180 r/min條件下培養12 h。再通過逐級擴培，轉至5 L三角瓶，接種量10%，30 ℃、180 r/min條件下培養8 h，作為分批補料發酵種子液。

1.3.2 馬克斯克魯維酵母的補料分批培養

按照1.1.3培養基配方，除了葡萄糖及氨水，磷酸二氫銨外，其他一次投入作為發酵底料，進行121℃滅菌 20 min。用磷酸調至pH=4.0后，按照15%接種量接入1.3.1擴培后的種子液。采用合適的補料策略，過程中流加葡萄糖（30%）、氨水（15%）和磷酸二氫銨（10%）。培養溫度30 ℃，初始攪拌轉速200 r/min，空氣流量恒定為50 L/min，罐壓恒定為0.045 MPa，10 h結束發酵。對發酵液進行分離，對收集的菌體進行兩次洗滌，測定菌體細胞的蛋白質、核糖核酸（Ribonucleicacid，RNA）、海藻糖等關鍵組分含量。

1.3.3 分析檢測

細胞干質量測定采用質量法[5]。酒精含量的測定采用馬丁儀滴定法[6]。CER、OUR在線生理學參數由發酵之星Biostar 1.5在線數據采集及分析軟件計算得出。相關生物量指標測定委托安琪酵母檢測中心進行檢測。

1.3.4 基于CFD模擬計算分析50 L反應器發酵液流場特性方法

采用軟件Gambit 2.4.6對原有的單管空氣分布器和提出的2種優化后的空氣分布器，分別在發酵罐內進行網格劃分及建立計算模型。通過ANSYS Workbench 18.2軟件完成三維模型的網格劃分[7]，網格類型選用非結構化四面體網格，且網格數目達到非依賴性狀態。

采用軟件Fluent模擬計算，選用Eulerian-ulerian模型進行氣液雙相流模擬，MRF方法模擬葉輪旋轉；湍流模型為標準κ-ε模型；氣體進口的邊界條件設定為速度進口，氣體出口的邊界條件設定為壓力出口，罐壁和擋板設定為無滑移壁面邊界；模擬類型選取瞬態模擬，最終采用SIMPLE算法進行求解，得出3種空氣分布器對應的流場特性。

2 結果與分析

反應器為菌體的高密度培養提供了一種無菌環境以及適合細胞生長的流體動力學環境[6]，主要包括攪拌、通氣和湍流。針對好氧型微生物培養，空氣分布器為反應器內的流場提供傳質動能，使整個反應器內獲得持續穩定的流場及能量、動量和物質傳遞，為菌株的生理代謝提供穩定合適的環境。基于CFD技術對配置不同空氣分布器的反應器進行流場特性的模擬計算分析，得出優化后的空氣分區器在應用到50 L馬克斯克魯維酵母發酵過程中，由于改善了發酵流場特性，進而實現了馬克斯克魯維酵母的高密度培養。

2.1 原有空氣分布器及2種優化后的空氣分布器結構

圖1中原有空氣分布器為單管式，基于多年發酵調控經驗及原始創新，提出兩種優化方案：opt1為單層環形分布器，環管上布有小孔，空氣出口方向向上；opt2所對應的氣體分布器為雙層環形管，環管上布有小孔，空氣出口方向向上。

圖1 空氣分布器的設計優化

2.2 發酵液氣含率云圖

氣含率是發酵液中氣相所占氣液混合物的體積分數，由氣含率云圖可知，空氣通過空氣分布器從發酵罐底部進入，并隨著整個攪拌流場的流動，最終從頂部逃逸出發酵液液面。 從圖2可看出裝配3種不同空氣分布器對反應器內整體和局部空氣分布的影響情況。原有氣體分布器流場的氣含率在發酵液中上層的大部分區域幾乎為0，而優化后氣體分布器流場的整體氣含率都顯著提高，尤其是opt2設計中發酵液中上層的大部分區域氣含率可提到0.03～0.08，明顯高于對照組。

圖2 發酵液氣含率云圖

氣含率參數可直觀反應氧氣在發酵液中的氣液混合傳質效果，進而直接影響好氧型微生物在培養過程中的攝氧能力，通常也是影響菌體生物合成快慢的關鍵限速因子。

2.3 發酵液流體速度場分布

通過CFD-post處理仿真數據得到反應器內速度場分布圖，如圖3為速度矢量圖，圖4為速度云圖。

圖3 速度矢量圖

圖4 速度云圖

通過速度矢量圖可直觀的表征反應器內的流場特性，如圖3所示，3種方案中的流體都經攪拌槳甩向發酵罐內壁，然后沿著罐壁軸向流動，在每層攪拌槳周圍都形成一個明顯的軸向循環。而原始空氣分布器的發酵罐底部，可看出液體的徑向循環十分微弱。在opt1中，采用單層環形向上的氣體分布器，其發酵罐底部的徑向流動作用明顯加強，湍動劇烈，但和原有的氣體分布器一樣，在發酵罐上部都存在流動作用比較弱的現象。在opt2中，采用雙層環形向上氣體分布器，加強了發酵罐底部的湍動作用，在增加的上層氣體分布器的進氣作用下，對發酵罐上部液體的徑向循環作用有明顯增強。從而提高發酵罐中的混合傳質效率，對發酵體系中菌體的有氧代謝十分有利。

流體速度分布云圖是表征反應器內各個層面流體的流動速度大小，從而反映出空氣（氧氣）在發酵液中動態混合分布的效果。通過CFD模擬計算，如圖4所示，配置原有氣體分布器的反應器內中上層混合流場流動比較單一，整體混合效果較差，而配置優化的opt1和opt2空氣分布器的發酵罐內，尤其是opt2空氣分布器組，其流場的整體混合流動層次呈現多樣性且更分散，發酵液中上層的流動混合效果明顯增強。

綜合圖3、圖4可直觀看出不同的氣體分布器可直接影響反應器中溶解氧的分布及氣液流體的混合效果。配置原始空氣分布器的發酵罐底部及中上層發酵液的氣液混合流動和溶解氧分布非常不均勻，發酵液中整體氣含率低，甚至存在發酵真空“死區”。而經過優化后的兩種空氣分布器均能增強整個發酵液的氣液流動混合效率，使發酵液中溶氧分布更為均勻。

2.4 不同空氣分布器對NAQU Plateau KM-Ⅵ高密度培養過程溶氧（DO）的影響

對在分別配置3種不同空氣分布器的3組平行發酵罐中進行的馬克斯克魯維酵母NAQU Plateau KM-Ⅵ培養過程進行溶氧DO的動態監測，當培養進入中后期，隨著菌體量的積累，反應器內溶氧水平顯著降低。從圖5看出，對照組反應器內溶氧DO值在4 h時就降至20%以下，5 h以后幾乎為0，可見對菌體的供氧明顯不足，此時酵母細胞的呼吸速率和生長速率均會受限，因此細胞比生長速率逐漸下降。而opt2組在6 h后，DO依然能維持在20%左右的水平來滿足NAQU Plateau KM-Ⅵ在對數生長末期對氧氣的需求，可見opt2的雙層環形空氣分布器對發酵液的供氧效果明顯由于對照組及opt1組。

圖5 3種不同分布器對KM-Ⅵ發酵過程DO曲線

2.5 不同空氣分布器對NAQU Plateau KM-Ⅵ高密度培養過程呼吸強度的影響

當OUR值近似等于CER值時，說明馬克斯克魯維酵母此時的好氧速率與二氧化碳釋放速率相近，表明此時酵母的呼吸代謝狀態90%以上為有氧呼吸，幾乎無酒精積累，即是菌體大量合成的階段，即圖6中反映出的OUR與CER曲線近似重合時段。

圖6 在線生理學參數CER、OUR曲線

在酵母高密度培養過程中，限制因素主要來自兩個方面：①供氧不足導致酵母發生無氧（厭氧）代謝，降低對糖的代謝速率，TCA好氧代謝途徑通量減慢，而EMP途徑通量增加進而代謝生成乙醇；②當培養基中的糖濃度較高時產生Crabtree效應也會產生乙醇。故溶氧的供給直接影響酵母對糖的代謝速率，從而影響菌體比生長速率。

采用發酵之星Biostar軟件在線監測50 L規模反應器中培養馬克斯克魯維酵母過程的耗氧速率OUR（Oxygen Update Rate）、二氧化碳釋放速率CER（Carbon Dioxide Release Rate）來表征不同氣體分布器對菌體呼吸強度的影響。如圖6所示，opt1和opt2組的OUR，CER峰值均高于對照組，同時由圖7的殘糖及酒精積累曲線可見，尤其是在對數后期8 h后，對照組及opt1組的發酵液殘糖、酒精積累含量均高于opt2組，經分析推測，opt2組發酵過程是在雙層環形分布器供氧條件下進行，再結合圖4發酵液中opt2的溶氧情況，均高于對照及opt1組，可見采用優化后的空氣分布器改善了發酵液流場的氧氣傳質效率，從而使菌體的有氧呼吸強度大大提升，顯著有利于菌體生長對數期的菌體量積累。

圖7 發酵液殘糖及酒精積累曲線

2.6 不同空氣分布器對NAQU Plateau KM-Ⅵ高密度培養過程生長特性的影響

圖8 菌體干重及比生長速率曲線

3 結論

在酵母的高密度培養過程中，發酵液中溶氧濃度的高低可直接影響菌體的呼吸強弱，進而影響菌體得率和積累速率。隨著菌體濃度的增加，為維持細胞群體呼吸強度，對反應器的供氧需求就會進一步增加，當通風量達到上限的情況下，此時發酵罐內溶氧水平進一步下降，當低于臨界氧濃度，就會限制菌體的進一步生長。

針對馬克斯克魯維酵母這類典型的好氧微生物發酵，只有在發酵后期提供充足的供氧及良好的氣液傳質效率，盡可能長時間維持菌體的高比生長速率，才能實現菌體的高密度放大生產。本文通過CFD技術模擬計算，對50 L通氣攪拌反應器的空氣分布器進行結構優化，得出2種優化的空氣分布器，相對于原有的單層管式空氣分布器，對發酵液流場特性的影響差異顯著。采用以上3組不同空氣分布器（1組對照，2組優化），進行50 L規模平行培養馬克斯克魯維酵母NAQU Plateau KM-Ⅵ，通過發酵液中溶氧的在線動態變化、菌體呼吸強度及殘糖、酒精、生物量等指標多維度對比分析，論證了原有的單層管式空氣分布器無法滿足NAQU Plateau KM-Ⅵ對數生長期后期的氧耗水平，而優化后的雙層圓環式空氣分布器，明顯改善了氧氣在發酵液各層面的傳質混合效果，從而能夠使發酵后期的溶氧水平維持在20%以上，延長了NAQU Plateau KM-Ⅵ對數生長期時間，實現了菌體量的快速積累。另外也間接說明溶解氧（DO）也是限制馬克斯克魯維酵母NAQU Plateau KM-Ⅵ實現高密度發酵的關鍵因素之一。本文的研究結果為實現馬克斯克魯維酵母的工業化規模生產及高密度培養提供了可靠的理論基礎及借鑒思路。