木犀草素/阿霉素雙載藥納米粒治療三陰乳腺癌的體外研究

常炳程，何蔚，夏志鴻

貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550003

臨床治療后腫瘤的轉移復發，是三陰乳腺癌的患者預后不良的首要原因［1-3］。近年來，各種天然中草藥活性成分正成為國內腫瘤藥物開發的熱點。木犀草素（luteolin，LUT），是一種提取自中草藥的黃酮類化合物，不僅具有免疫調節、抗氧化、抗菌、解痙等多重藥理活性，同時對多種腫瘤的耐藥和轉移均有強效抑制作用，在三陰乳腺癌的治療方面極具潛力［4-8］。然而，木犀草素在水溶液中溶解度與藥劑溶出速率極低，且在胃腸道中易被微生物降解，難以通過口服吸收的方式遞送至腫瘤組織發揮療效［8-10］。由此可見，我們急需開發一種能高效運載木犀草素到達病灶部位發揮藥理活性的藥物遞送體系。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic acidglycolic acid），PLGA］是一種應用廣泛的藥用輔料，其能夠在人體內完全降解為無害的乳酸小分子，生物相容性極好［11］。本研究采用單乳法制備了一種可高效包封木犀草素的納米粒（PLGA-NPs@DOX/LUT），并同時搭載了模式化療藥物阿霉素（doxorubicin，DOX）與其配伍，研究其對三陰乳腺癌轉移的治療作用。

1 實驗儀器、材料和方法

1.1 儀器和試劑

PLGA（羧基末端，50∶50，分子量24 000～38 000），PVA（聚乙烯醇；醇解度：98.0～99.0 mol%，黏度：5.2～6.0 mPa.s）；木犀草素、N，N-二甲基甲酰胺、甘露醇等化學試劑均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸阿霉素購自武漢卡諾斯科技有限公司；MBA-MD-231 三陰乳腺癌細胞系來源于中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫；MTT 試劑盒與細胞培養生化試劑均采購來白鯊公司。

800 目銅碳網購自中鏡科儀；萊恩德全自動多功能酶標儀；日立CF-RN 冷凍高速離心機；奧林巴斯CKX53 倒置相差顯微鏡；Elma P300H 超聲波清洗儀；Nano S90 激光粒度儀（英國馬爾文公司）Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Avestin LF-1 脂質體擠出器；賽默飛Forma310/311 二氧化碳培養箱；Corning 公司24 孔板Transwell 3422，8 μm。

1.2 PLGA-NPs@DOX/LUT 與對照組納米粒構建

首先將PLGA 3.5 mg，LUT 0.8 mg，脫鹽后的DOX 1 mg，溶解于3 mL 體積比為2∶1 氯仿/乙醇混合溶液中待用。配制6 mL 濃度5 %的PVA水溶液，并將上述PLGA 混合溶液用針頭在超聲波清洗儀中逐滴加入，繼續超聲5 min 后，將所有溶液轉移至小燒瓶中，并同時加入0.5 % PVA溶液15 mL，敞口揮發有機溶液，磁力攪拌過夜，轉速1 000 rpm。12 h 后，收集所有溶液，短暫超聲分離后低速離心5 min（3 000 r/min）除去大顆粒。接著高速離心30 min（18 000 r/min），收集沉淀并重新分散保存于甘露醇水溶液中，最終利用脂質體擠出器過膜0.4 μm，得到納米粒PLGA@DOX/LUT。

對照組單藥納米粒與無藥納米粒PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT、PLGA-NPs 均僅在原料中省去對應成分并采用相同方法構建。

所有藥物合成材料與環境均經過無菌過濾處理，而且納米藥物在進入細胞實驗前需利用0.4 μm濾膜除菌后使用。

1.3 納米粒基本表征

電鏡拍攝：取納米粒純水分散液數滴置于800 目銅碳網上，室溫晾干后用磷鎢酸負染液（0.2%）染色5 min，再用蒸餾水再次潤濕后自然干燥。最后將標本寄送至三方電鏡檢測平臺送測。掃描電鏡直接取標本凍干粉末寄送；激光粒度儀檢驗：取納米粒0.1 mg 超聲分散于3 mL PBS 溶液中，直接使用電勢粒度專用池子探頭進行檢驗；體外穩定性測試：取納米粒0.1 mg 超聲分散于3 mL PBS 溶液中，分別在既定時間點檢測其粒徑變化；載藥量測試：取納米粒1 mg 溶解于20 mL 的氯仿/乙腈（3∶1）混合溶液中，充分過濾后，旋干后使用展開劑復溶，利用HPLC檢測其中木犀草素與阿霉素含量。標準曲線使用購買的原料藥倍比稀釋配制而成。計算公式：載藥量=（溶出藥物質量/所溶解的總納米粒質量）×100%。

1.4 體外藥物釋曲線

取納米粒1 mg 分散于pH 7.4 的PBS 或者pH 5.0的醋酸鹽緩沖液中，置于恒溫箱（37 ℃）震蕩；按預設時間定時取出分散液，離心分離上清待測，并重新加入等量新鮮緩沖液，并重復此操作；最后將不同時間點的待測上清溶液凍干后，用以上HPLC流動相復溶并檢測，計算每個時間節點的累計藥物釋放量并繪圖。

1.5 細胞毒性實驗

細胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基培養擴增后，將消化分散后的MDA-MB-231細胞分別按4 000 個細胞每孔的濃度，鋪入96 孔板。24 h 后，將每孔原有培養基更換為含有梯度濃度（倍比稀釋阿霉素濃度：5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μg/mL）的游離阿霉素DOX、PLGA-NPs@DOX/LUT、PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT、PLGA-NPs 或PBS 的培養基，繼續培養48 h，接著更換含有MTT 的培養基繼續培養3 h。小心吸去上清后，加入DMSO 溶解紫色結晶并使用酶標儀檢測490 nm 處吸光度。

1.6 Transwell 遷移與侵襲實驗

細胞遷移：將游離DOX/LUT、PLGA-NPs@DOX/LUT、DOX、DOX 0.02 mg/mL 或PBS 混入無血清培養基，并且取8 000 個MDA-MB-231 細胞分散至150 μL 無血清培養基中，滴入Transwell 小室薄膜上層，然后將小室放置于小孔中，并在小孔下層加入1 mL 無血清培養基。培養24 h 后，取出Transwell 小室，抹去薄膜上層細胞，多聚甲醛固定細胞后，用0.1%結晶紫染色2 min 后，觀察下層遷移過薄膜的細胞。

細胞侵襲實驗在加入細胞前需要先在小室上層鋪入50 μL11% BD Matrigel 基質膠。后續與細胞遷移實驗一致，但培養時間需延長至48 h 后再染色觀測。

1.7 統計學方法

項目數據使用SPSS 軟件分析。數據均采用t檢驗評價實驗組與對照組差別，每一項數據的收集n=3。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT 的基本性能表征

首先通過透射電鏡觀察，PLGA-NPs@DOX/LUT 納米粒呈規則圓球形，分散狀態良好，未發現團聚現象（見圖1）；結合激光粒度儀的動態光散射數據，發現納米粒水合粒徑約為114.8 nm，表面電勢為（-15.46 mV)；而且通過溶液萃取納米粒，并利用高效液相色譜分析可知，其實現了難溶性天然中草藥組分木犀草素與阿霉素的高效包封，對阿霉素載藥量為18.11 %，木犀草素10.15 %，分散性與表面電勢也基本符合課題設計要求（見表1）。

圖1 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT的電鏡照片：

此外，動態光散射數據顯示，對照給藥組PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT、PLGA-NPs 粒徑與實驗組尺寸相似，粒徑均為120 nm 左右，載藥量差異不大（見表1）。

表1 納米粒動態光散射檢測數據與載藥量（）

表1 納米粒動態光散射檢測數據與載藥量（）

2.2 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT 的體外藥物釋放

首先，通過體外穩定性測試實驗可見，PLGANPs@DOX/LUT 在含有10%胎牛血清的細胞培養基環境下結構相對穩定，粒徑在32 h 內變化不明顯，見圖2A。

圖2 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT藥物穩定性測試與藥物釋放曲線：A.體外穩定性測試；B.藥物釋放曲線

通過藥物釋放實驗可見，納米粒中包封的藥物在中性環境下藥物釋放緩慢，而當我們利用微酸緩沖液模擬腫瘤微環境時發現木犀草素在72 h內均勻緩釋，阿霉素釋放相對較快48 h 內就釋放超過80%，最終實現了兩種封裝藥物的共同釋放，見圖2B。

2.3 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT 的三陰乳腺癌細胞毒性實驗

為了評價PLGA-NPs@DOX/LUT 對于三陰乳腺癌細胞的抑制效果，我們選用了MBA-MD-231 細胞通過MTT 細胞毒性實驗進行測試。在相同藥物濃度條件下，可見PLGA-NPs@DOX/LUT 的加入明顯比單藥納米組PLGA-NPs@DOX、PLGA-NPs@LUT 對腫瘤細胞的毒性更強（見圖3）。經過計算，同樣可知PLGA-NPs@DOX/LUT 中阿霉素的IC50 僅為0.628 μg/mL，遠低于單藥組納米粒（PLGA-NPs@DOX 3.475 μg/mL ;PLGA-NPs@LUT >5 μg/mL）。

圖3 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT的腫瘤細胞殺傷能力

2.4 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT 對三陰乳腺癌轉移與侵襲的抑制效果

為了在體外評價PLGA-NPs@DOX/LUT 對于三陰乳腺癌細胞轉移復發的抑制效果，我們利用了Transwell 細胞遷移與侵襲實驗進行評估。在相同藥物濃度的配比下，可見PLGA-NPs@DOX/LUT 能夠最大限度地降低三陰乳腺癌細胞的遷移能力與侵襲能力，與傳統化療組游離DOX組對比有統計學意義。（見圖4）。

圖4 納米粒PLGA-NPs@DOX/LUT對三陰乳腺癌細胞的遷移與侵襲抑制能力：A細胞遷移實驗與統計結果；B細胞侵襲實驗與統計結果

3 討論

在近幾十年的發展中，納米藥物遞送系統得到飛速的發展，然而我國傳統中草藥中天然組分的制劑研究卻還遠遠落后，難以滿足當前中草藥制劑現代化改革的需求。本課題組從貴州本省道地藥材白毛夏枯草的調研中發現，其主要抗癌活性成分木犀草素具有抗腫瘤復發轉移、抗炎和免疫調節多種藥理作用［7,12-14］。但受制于其溶解性差、口服給藥效率極低的問題，嚴重制約了其在臨床一線的應用［15］。

本研究將木犀草素與模式抗癌藥物阿霉素共同封裝于PLGA 納米顆粒之中，初步地解決了傳統中草藥活性成分藥物遞送效率較低的問題。通過三陰乳腺癌的細胞殺傷性實驗與細胞遷移侵襲實驗證明，納米藥物遞送系統能夠有效實現木犀草素的有效包封，使其與化療藥物形成協同抗癌效應，有希望緩解三陰乳腺癌的復發轉移。然而，本研究僅實現了納米藥物遞送系統的初步構建與體外藥效驗證，其在體內的有效性以及靶向藥物遞送效率尚有待考察，今后還需進一步研究。