miR-126過表達對增生性玻璃體視網膜病變大鼠的干預作用及機制研究

徐智科 李臻 蒲一民

增生性玻璃體視網膜病變是一種臨床較為常見的眼科疾病，常見發病部位為機體視網膜組織，主要臨床表現為玻璃體混濁，并出現棕色顆粒，視網膜組織僵硬并出現皺褶[1,2]。大量臨床研究表明，增生性玻璃體視網膜病變癥狀的發生發展會導致機體視力出現嚴重缺損，對患者身體健康、生活質量造成嚴重影響[3,4]。目前臨床較為常用的治療增生性玻璃體視網膜病變的手段包括手術治療、藥物治療等，但治療效果并不理想[5,6]。臨床醫學尚無一種特效的治療增生性玻璃體視網膜病變的手段，因此探究增生性玻璃體視網膜病變發病機制，尋找新的治療靶點，對增生性玻璃體視網膜病變的治療具有重要意義[7,8]。本文研究中建立增生性玻璃體視網膜病變大鼠模型，靶向調控miR-126表達，旨在探究過表達miR-126對增生性玻璃體視網膜病變的干預效果。

1 材料與方法

1.1 材料 選取40只SD健康雄性大鼠，由吉林大學動物實驗中心提供[許可證號：SYXK(吉)2021-0006]，月齡9～10月，平均(9.5±0.4)月；體重219～232 g，平均體重(226.1±5.2)g。在相對濕度45%～55%、溫度(24.1±2.2)℃的環境中喂養大鼠1周，光照12 h/d。本文研究獲我院倫理委員會批準。主要試劑：兔抗大鼠miR-126、血管內皮生長因子(VEGF)抗體(Gibco公司)；兔抗小鼠TGF-β1抗體(Dako公司)；大鼠抗小鼠超敏C-反應蛋白(hs-CRP)、白介素-17(IL-17)抗體(Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)抗體(Hyclone公司)；小鼠抗兔脂質過氧化物(LPO)、丙二酯(MDA)抗體(BD公司)；大鼠抗小鼠E-cadherin抗體(Sigma公司)；大鼠抗兔vimentin、snail抗體(Selleck公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組:隨機選取10只大鼠作為本文研究正常組，不做任何處理。其余30只大鼠建立增生性玻璃體視網膜病變模型：以大鼠右眼為實驗眼。采集大鼠尾部靜脈血1 ml制備富含血小板血漿(PRP)。麻醉干預后是大鼠右眼暴露于術野之中，于顯微鏡下操作，自距角膜緣2 mm位置向大鼠玻璃體內注入1 U透明質酸酶，10 min后玻璃體液化，自距角膜緣2 mm位置向大鼠玻璃體內注入20 μl PRP，7 d后注射20 μl 0.9%氯化鈉溶液。miR-126沉默組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg antagomiR-126，miR-126過表達組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg agomiR-126，正常組、模型組大鼠大鼠尾部靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 血流動力學變化檢測:所有大鼠干預結束后，對大鼠右眼進行彩色多普勒檢查，檢測指標包括血流動力學指標收縮期峰值血流速度(Max)、舒張末期流速(Min)、平均血流速度(TAMx)。

1.2.3 標本制備、HE染色:取各組大鼠尾部靜脈血2 ml,2 000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80℃環境中保存待檢。對4組大鼠進行麻醉處理后，斷頭法處死，取大鼠眼球，取出球外組織，固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常規石蠟包埋及連續切片。將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的乙醇中各復水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸乙醇分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用乙醇進行脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察。

1.2.4 miR-126、VEGF mRNA表達檢測:RT-PCR檢測miR-126、VEGF mRNA表達。提取細胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件設計引物，采用-△△Ct方法計算，內參U6。設置反轉錄反應條件：25℃ 10 min,40℃ 60 min,85℃ 5 min；設置擴增條件:94℃ 20 s、72℃ 30 s、60℃ 30 s,35個循環，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的miR-126、VEGF mRNA表達量。

1.2.5 酶聯免疫吸附實驗法檢測hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平:將待測標本置于室溫后，標記酶標板，制作標準品，然后取出試劑盒，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應孔上依次加入稀釋好的待測血清和標準品100 μl/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；然后用專用的洗滌液將反應板清洗3次以后，再加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100 μl/孔，放于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續清洗反應板4次后，在反應孔內加入TMB溶液100 μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應孔內加入終止液100 μl/孔終止反應，在450 nm波長測定吸光度，顏色反應深淺與hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平成正比，經繪制標準曲線計算hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平。

1.2.7 E-cadherin、vimentin、snail相對表達量檢測:蛋白質印跡法檢測E-cadherin、vimentin、snail表達：取150℃ Ripa裂解液,1.5℃ PMSF冰中孵育30 min,1 500 r/min離心15 min，取上清。每個樣品取15 g蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉入PDVF膜，5%脫脂牛奶常溫下密封2 h。加入抗體過夜。取出后使用TBST液沖洗，結合二抗，60 min后清洗、顯色，對E-cadherin、vimentin、snail相對表達量進行檢測。

2 結果

2.1 4組大鼠眼球組織病理學觀察圖 正常組大鼠眼球組織結構完好，視網膜結構無變化；模型組、miR-126沉默組大鼠出現嚴重的視網膜脫落情況；miR-126過表達組大鼠視網膜脫落情況明顯改善，眼球組織結構基本完好。見圖1。

正常組 模型組 miR-126沉默組 miR-126過表達組

2.2 4組大鼠miR-126、VEGF mRNA表達比較 與正常組比較，模型組、miR-126沉默組、miR-126過表達組大鼠miR-126表達較低，VEGF mRNA表達較高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組、miR-126沉默組比較，miR-126過表達組大鼠miR-126表達較高，VEGF mRNA表達較低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠miR-126、VEGF mRNA表達比較

2.3 4組大鼠Max、Min、TAMx水平比較 與正常組大鼠比較，模型組、miR-126沉默組、miR-126過表達組大鼠Max、Min、TAMx水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組、miR-126沉默組比較，miR-126過表達組大鼠Max、Min、TAMx水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠Max、Min、TAMx水平比較

2.4 4組大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平比較 與正常組比較，模型組、miR-126沉默組、miR-126過表達組大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-126沉默組大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平高于模型組，且miR-126過表達組大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平低于模型組、miR-126沉默組，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平比較

表4 4組大鼠T淋巴細胞亞群比較

2.6 4組大鼠E-cadherin、vimentin、snail表達比較 與正常組大鼠比較，模型組、miR-126沉默組、miR-126過表達組大鼠E-cadherin表達較低，vimentin、snail表達較高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組、miR-126沉默組比較，miR-126過表達組大鼠E-cadherin表達較高，vimentin、snail表達較低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5，圖2。

表5 4組大鼠E-cadherin、vimentin、snail表達比較

圖2 E-cadherin、vimentin、snail表達WB圖;A 正常組；B 模型組；C miR-126沉默組；D miR-126過表達組

3 討論

增生性玻璃體視網膜病變是一種常見的孔源性視網膜脫離術后并發癥，主要是指術后機體視網膜、玻璃體組織纖維增殖膜收縮導致視網膜再次脫離[9-11]。有研究表明，增生性玻璃體視網膜病變是一種由細胞外基質、細胞因子等因素參與的較為復雜的病理過程，因此手術治療效果并不理想，許多專家學者開始致力于增生性玻璃體視網膜病變臨床治療的研究[12,13]。目前為止，臨床醫學尚未將增生性玻璃體視網膜病變的發病機制研究透徹，許多專家學者通過分子生物學、基礎醫學等途徑對增生性玻璃體視網膜病變發病機制進行研究[14]。

微小RNA(miRNA)在大多數生物中大量存在，miRNA與機體炎性反應、免疫狀態、微生物感染等多種病理學變化具有密切聯系，miR-126為miRNA家族的組成成員，在視網膜病變中表達出現明顯異常，但是關于調控miR-126表達對增生性玻璃體視網膜病變干預效果的研究還鮮有報道[15]。增生性玻璃體視網膜病變癥狀的發生發展與視網膜組織細胞增生、新生血管形成具有密切聯系，VEGF是一種血管通透因子，在新生血管形成過程中發揮重要作用[16]。本文研究結果顯示，與正常大鼠相比，增生性玻璃體視網膜病變大鼠miR-126表達較低，VEGF mRNA表達較高，過表達miR-126表達的增生性玻璃體視網膜病變大鼠miR-126表達上調，VEGF mRNA表達下調，出現這一研究結果的原因可能是上調miR-126表達能夠靶向調控VEGF mRNA表達，抑制增生性玻璃體視網膜病變大鼠視網膜組織新生血管形成。

大量臨床實驗研究表明，視網膜病變的發生發展會對視網膜血流動力學水平造成嚴重的影響，檢測視網膜血流動力學水平能夠對視網膜病變嚴重程度、臨床治療效果進行評價[17,18]。本文研究結果顯示，相比正常大鼠，增生性玻璃體視網膜病變大鼠Max、Min、TAMx水平明顯下降，說明增生性玻璃體視網膜病變癥狀的發生發展伴隨著血流動力學水平異常。本文研究還發現，過表達miR-126表達的增生性玻璃體視網膜病變大鼠Max、Min、TAMx水平明顯上升，說明過表達miR-126能夠起到改善增生性玻璃體視網膜病變大鼠視網膜組織血流動力學水平的作用。

增生性玻璃體視網膜病變癥狀的發生發展伴隨著炎性反應。hs-CRP、IL-17、TGF-β1是臨床常用的炎性因子，檢測hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平變化能夠對身體炎性反應嚴重程度變化情況進行評價。本文研究結果顯示，相比正常大鼠，增生性玻璃體視網膜病變大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平較高，說明增生性玻璃體視網膜病變癥狀的發生發展伴隨著炎性反應。本文研究還發現，過表達miR-126表達的增生性玻璃體視網膜病變大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平出現下降，說明過表達miR-126能夠調控hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平，從而起到抑制視網膜組織炎性反應的作用。

有研究表明，視網膜組織上皮細胞上皮-間充質轉化與增生性玻璃體視網膜病變癥狀的發生發展具有密切聯系[19-22]。E-cadherin、vimentin、snail是常用的上皮-間充質轉化相關基因，三者表達的變化與機體組織細胞增殖、轉移密切相關。本文研究結果顯示，相比正常大鼠，增生性玻璃體視網膜病變大鼠E-cadherin表達較低，vimentin、snail表達較高，過表達miR-126表達的增生性玻璃體視網膜病變大鼠E-cadherin表達上調，vimentin、snail表達下調，出現這一研究結果的原因可能是增生性玻璃體視網膜病變伴隨著視網膜上皮細胞上皮-間充質轉化，過表達miR-126能夠調控E-cadherin、vimentin、snail表達，阻斷視網膜上皮細胞向肌成纖維細胞轉化，從而發揮干預效果。

綜上所述，上調增生性玻璃體視網膜病變大鼠miR-126表達，能夠靶向調控VEGF mRNA，抑制大鼠視網膜新生血管形成，改善血流動力學水平，減輕炎性反應，阻斷視網膜上皮細胞上皮-間充質轉化，為增生性玻璃體視網膜病變的臨床治療提供參考依據。