miR-1271靶向MTDH基因調控子宮內膜癌細胞侵襲遷移的分子機制

王乾印 高文君 丁鑫

子宮內膜癌是女性生殖道系統常見的惡性腫瘤之一，近年的發病率呈升高趨勢，嚴重威脅女性健康[1]。子宮內膜癌的異常增殖及惡化是其發生發展的主要原因之一，因此，尋找有效的子宮內膜癌治療靶點具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼的小分子RNA，長度為18～22nt，可在轉錄水平上調控相關基因表達，從而參與機體多種生命活動過程，其異常表達可促進腫瘤發生[2,3]。miR-1271定位于ARL10基因的第2個內含子區域，有研究顯示，多種腫瘤中miR-1271可通過抑制不同的靶基因，從而抑制腫瘤細胞生長[4-6]。子宮內膜癌中miR-1271的研究較少，有研究顯示，過表達miR-1271可通過靶向抑制CDK1降低子宮內膜癌細胞增殖及誘導細胞凋亡[7]，但miR-1271對子宮內膜癌細胞侵襲遷移的影響及機制尚未明確。異粘蛋白(Metadherin，MTDH)是近年發現的一個癌基因，多種腫瘤中MTDH呈高表達，其高表達可促進腫瘤進展[8,9]。有研究顯示，MTDH在子宮內膜癌中表達升高，敲除MTDH可減弱腫瘤壞死因子-α相關凋亡誘導配體(TRAIL)和組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑LBH589聯合治療引起的腫瘤耐藥性[10]。有研究顯示，miR-1271可通過調控HDAC/Wnt信號通路抑制結直腸癌細胞的增殖和侵襲能力[11]。本研究以人子宮內膜癌RL95-2細胞為研究對象，旨在miR-1271靶向調節MTDH對RL95-2細胞侵襲遷移的影響，并進一步研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人子宮內膜癌RL95-2細胞購自美國ATCC。DMEM培養基、胎牛血清均購自美國Hyclone公司；miR-1271 mimics及對照miR-NC、miR-1271 inhibitor及對照anti-miR-NC、MTDH siRNA及陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；LipofectamineTM 2000試劑盒、Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell小室購自美國Coming公司；E-cadherin、N-cadherin和Vimentin抗體均購自美國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒購自中國碧云天生物；ECL發光液購自美國Santa cruz公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；PCR儀購自美國Thermo公司。

1.2 細胞培養 RL95-2細胞使用含有10 %胎牛血清的新鮮的DMEM培養基，放置于5%體積分數CO2、37℃恒溫恒濕培養箱培養，細胞呈現貼壁增殖，細胞達80%～90%生長融合度時，胰酶消化、傳代，取生長至對數期的細胞用于實驗研究。

1.3 細胞轉染 取生長狀態良好的RL95-2細胞，以5×105個/孔均勻的接種于6孔板中，每孔2 ml，使用無血清培養基培養，細胞覆蓋達到80 %時即可進行轉染。轉染參照LipofactmineTM 2000說明，使用無血清培養基分別稀釋miR-1271 mimics(miR-1271組)及對照miR-NC、miR-1271 inhibitor(anti-miR-1271組)及對照anti-miR-NC、MTDH siRNA(si-MTDH組)及陰性對照(si-NC組)和si-MTDH+anti-miR-1271作為A液，使用無血清培養基稀釋Lipofactmine 2000作為B液?；靹駻液和B液，室溫孵育20 min。將混合液加入6孔板中，培養箱中常規孵育6 h。更換為含血清的DMEM培養基，繼續培養48 h，用于后續實驗。

1.4 qRT-PCR檢測miR-1271基因表達 采用Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA含量，取1 mg/ml總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR反應，反應體系20 μl，其中cDNA 2 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，2×SYBR Green PCR Master mix 10 μl，加ddH2O定容至20 μl。反應條件95℃預變性1 min；(95℃變性15 s；60℃退火1 min)循環40次。PCR引物由上海生工合成，引物序列：miR-1271 F 5’-CAGCACTTGGCACCTAGCA-3’,R 5’-TATGGTTGTTCTCCTCTCTGTCTC-3’；內參U6 F 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,R 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。以U6作為內參，采用2-△△Ct法計算miR-1271基因相對表達量。設置5個復孔，實驗重復3次。

1.5 Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移 細胞侵襲檢測時Transwell小室的聚碳酸脂膜上需鋪Matrigel基質膠，細胞遷移檢測不需鋪Matrigel基質膠，其他操作步驟一致。使用無血清培養基稀釋Matrigel，將稀釋后的Matrigel鋪在Transwell小室的聚碳酸脂膜上，將小室放入24孔板內，5%體積分數CO2、37℃培養箱孵育30 min，基質膠凝固后，吸除殘留液體。胰酶消化各組細胞，制備成單細胞懸液，并調整細胞濃度為1×105個/100 μl。上室中每孔加100 μl單細胞懸液，下室中每孔加500 μl含血清的培養基，于培養箱常規孵育24 h。取出小室，棉簽輕輕擦掉基質膠及上室細胞，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶紫染色1 min。高倍顯微鏡下隨機選擇5個視野(上、中、下、左、右)，計數穿膜細胞數。每種處理設置3個復孔，實驗重復3次。

1.6 Western blotting檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達 收集各處理組細胞沉淀，加入適量RIPA細胞裂解液，在冰上反應30 min，離心，收集上清。BCA法定量蛋白。上清液與5×上樣緩沖液混勻，100℃變性5 min。取等量變性蛋白上樣，經SDS-PAGE電泳、轉移至PVDF膜后，使用5%的脫脂奶粉封閉膜2 h，加入1∶1 000稀釋的一抗溶液(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin抗體)，4℃孵育過夜。TBST洗膜，加入1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗，室溫孵育2 h，洗膜。加入ECL，暗室中用X線膠片曝光，常規顯影、定影。Quantity One軟件分析條帶灰度值。實驗重復3次。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗 在線生物信息學軟件顯示miR-1271和MTDH存在結合位點。構建MTDH 3’UTR野生型(WT)及突變型(MUT)載體，并插入pMIR-REPORT miRNA Expression Reporter載體中產生WT/MUT-MTDH-3’UTR質粒。使用LipofactmineTM2000將WT/MUT-MTDH-3’UTR質粒分別與miR-1271 mimics和miR-NC共轉染至RL95-2細胞。轉染48 h，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統測定熒光素酶活性。

2 結果

2.1 上調miR-1271表達可抑制RL95-2細胞侵襲和遷移 miR-1271 mimics轉染RL95-2細胞48 h，qRT-PCR結果顯示，miR-1271組miR-1271基因表達明顯高于miR-NC組(P<0.05)。Transwell小室結果顯示，miR-1271組細胞侵襲和遷移數均明顯低于miR-NC組(P<0.05)。見表1。

表1 上調miR-1271表達對RL95-2細胞侵襲和遷移的影響

2.2 上調miR-1271表達對RL95-2細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達的影響 Western blotting檢測侵襲遷移相關E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達，結果顯示，與miR-NC組比較，miR-1271組E-cadherin表達明顯升高，N-cadherin和Vimentin表達明顯降低(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 上調miR-1271表達對RL95-2細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達的影響

表2 E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白相對表達量

2.3 miR-1271靶向下調MTDH表達 靶基因預測軟件顯示miR-1271與MTDH有相互作用的位點。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-1271 mimcis與MTDH野生型共轉染后熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而與MTDH突變型共轉染后熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。Western blotting檢測結果，轉染miR-1271 mimics的RL95-2細胞MTDH表達明顯降低，轉染miR-1271 inhibitor的細胞MTDH表達明顯升高(P<0.05)。提示miR-1271和MTDH存在靶向關系，miR-1271可負調控MTDH表達。見圖2，表3。

圖2 miR-1271和MTDH的結合位點及轉染miR-1271 mimics/inhibitor的細胞MTDH表達

表3 2組細胞雙熒光素酶活性

2.4 miR-1271通過下調MTDH抑制RL95-2細胞侵襲遷移 RL95-2細胞轉染MTDH siRNA后，與si-NC組比較，MTDH表達明顯降低，細胞侵襲和遷移數明顯降低(P<0.05)。MTDH siRNA與anti-miR-NC共轉染后，與si-MTDH組比較，MTDH表達及細胞侵襲和遷移數差異均無統計學意義(P>0.05)。MTDH siRNA與miR-1271 inhibitor共轉染同時抑制MTDH和miR-1271表達，與si-MTDH+anti-miR-NC組比較，MTDH表達明顯升高，細胞侵襲和遷移數明顯升高(P<0.05)。見圖3，表4。

表4 miR-1271靶向調節MTDH對RL95-2細胞侵襲遷移的影響

圖3 Western blotting檢測各轉染組細胞MTDH表達

2.5 miR-1271通過下調MTDH抑制RL95-2細胞EMT 抑制RL95-2細胞MTDH或同時抑制MTDH和miR-1271表達后，Western blotting檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達，結果顯示，與si-NC組比較，si-MTDH組 E-cadherin表達明顯升高，N-cadherin和Vimentin表達明顯降低(P<0.05)。與si-MTDH+anti-miR-NC組比較，si-MTDH+anti-miR-1271組E-cadherin表達明顯降低，N-cadherin和Vimentin表達明顯升高(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 miR-1271靶向MTDH對RL95-2細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達的影響

表5 4組細胞 E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白相對表達量

3 討論

miRNAs是一類單鏈RNA分子，在生物體中廣泛存在，可通過與靶mRNA的3’UTR結合調節轉錄后的mRNA，降低mRNA或抑制其翻譯，從而參與細胞增殖、侵襲遷移、凋亡等過程[12]。越來越多研究表明，miRNAs可通過靶向下游的促癌或抑癌基因，進而促進或抑制子宮內膜癌細胞生長[13]。miR-1271是miRNAs家族新成員，在多種腫瘤中有獨特作用，受到研究者廣泛關注。有研究顯示，miR-1271可通過靶向HOXA5促進非小細胞肺癌增殖和侵襲[14]；miR-1271可靶向抑制DIXDC1降低前列腺癌細胞增殖和侵襲[15]；miR-1271可通過靶向ALK抑制口腔鱗癌細胞生長和轉移[16]。本研究將miR-1271 mimics轉染子宮內膜癌RL95-2細胞，miR-1271基因表達明顯升高，細胞侵襲能力明顯降低，E-cadherin表達明顯升高，N-cadherin和Vimentin表達明顯降低。腫瘤細胞上皮間質轉化(EMT)與侵襲轉移行為密切相關，EMT可導致上皮細胞失去極性，細胞間粘連降低，細胞獲得侵襲和遷移能力[17]。在EMT過程中，上皮標志物E-cadherin表達降低，間質標志物Vimentin、N-cadherin等表達增加。有研究顯示，miR-1271可通過靶向ZEB1和TWIST1 抑制胰腺癌細胞侵襲遷移和EMT[18]；miR-1271可通過靶向Emodin抑制胰腺癌細胞侵襲及EMT[19]。本研究結果提示上調miR-1271表達可抑制子宮內膜癌細胞侵襲遷移，機制可能與抑制EMT有關，這與在其他腫瘤研究結果一致。

本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實MTDH是miR-1271的靶基因。通過使用miR-1271 mimics/inhibitor證實MTDH表達受miR-1271調控，進一步證實miR-1271和MTDH存在靶向關系。抑制MTDH表達可降低RL95-2細胞侵襲遷移，上調E-cadherin表達，下調N-cadherin和Vimentin表達，而將miR-1271 inhibitor與MTDH siRNA共轉染至RL95-2細胞，發現抑制miR-1271表達可減弱抑制MTDH表達對RL95-2細胞侵襲遷移及E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達的影響。MTDH是腫瘤惡化的一個關鍵分子，可促進腫瘤侵襲轉移、血管生長等多種生物學行為[20]。最近多項研究表明，miRNA-MTDH調控軸可影響腫瘤細胞生長。王淑芬等[21]研究顯示，miR-26a可通過調節MTDH抑制卵巢癌細胞增殖；Zhang等[22]研究顯示，miR-217可通過靶向MTDH抑制肝癌細胞增殖、侵襲遷移及促進細胞凋亡；Qi等[23]研究顯示，miR-145和miR-497 可通過靶向MTDH抑制TGF-β誘導的非小細胞肺癌EMT。本研究結果提示miR-1271可通過靶向MTDH基因抑制子宮內膜癌細胞侵襲遷移及EMT。

綜上所述，過表達miR-1271及抑制MTDH表達均可降低子宮內膜癌細胞侵襲和遷移能力，miR-1271可通過靶向MTDH抑制子宮內膜癌細胞侵襲遷移和EMT。miR-1271和MTDH可能是子宮內膜癌診療的潛在標志物，miR-1271/MTDH分子軸可能是子宮內膜癌治療的一個新思路。