上調miR-34對口腔癌細胞增殖、凋亡能力及周期分布的影響

王康浴 王裕洲 陳海鵬 李國良 鄧國磊

口腔癌是常見的惡性腫瘤，主要是發生于口腔上皮細胞，其中有80%屬于鱗狀上皮細胞癌，在全球常見腫瘤中居于第六位[1]。口腔癌的發病因素復雜，長期飲酒、吸煙、營養不良、口腔衛生差等都會可能引發口腔癌[2]。近年來我國口腔癌發病率呈上升趨勢，由于口腔癌早期發病隱蔽無特異性表現，大部分患者確診是已發展成中晚期[3]。目前口腔癌的五年生存期超過60%，早期診斷，早期治療，對提高患者的生存質量和生存時間有重要意義[4,5]。本文研究中設計實驗，通過上調miR-34細胞對口腔癌細胞進行實驗，旨在探究上調miR-34對口腔癌細胞增殖、凋亡能力及周期分布的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 研究細胞：口腔癌細胞(中國醫學科學院)。大鼠抗小鼠Bcl-2抗體(Sigma 公司)；免疫小鼠Bax抗體(BD公司)；小鼠抗大鼠caspase3抗體(Gibco公司)；免疫大鼠MMP-9、ICAM-1抗體(Hyclone公司)。本實驗獲醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:在40℃的環境中對凍存的口腔癌細胞進行火浴處理(40℃)，之后進行充分搖晃，將搖晃均勻的口腔癌細胞置于2 ml的培養基(10%PBS、1%雙抗(青鏈霉素)RPMI-1640培養基500 ml)之內，之后使用2 000 r/min的離心機進行離心處理，進行重懸處理后將細胞傳代，使用CO2培養箱對培養基培養24 h、換液，細胞融合率達90%后傳代。

1.2.2 慢病毒載體構建及分組:miR-34基因序列根據質粒特點進行引物設計，引入SacⅠ酶切位點(由上海生工生物工程技術服務有限公司完成)，miR-34下游序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3。GIT1上游序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3。正反鏈混合后加入退火緩沖液，96℃反應4 min，室溫冷卻，生成雙鏈。使用Eco31Ⅰ酶切線性化質粒pGenesil-1，100倍稀釋退火產物之后與其連接，20℃下水浴孵育過夜，使用大腸桿菌DH5α轉化，第2d選擇單克隆菌落，在30 μg/ml Kana的LB培養液中接種，2 000 r/min離心處理，37℃下震混，孵育過夜。少量抽提質粒后使用SacⅠ酶切進行鑒定(由寶生物工程(大連)有限公司完成)，分為空白組、上調miR-34組和下調miR-34組,重懸處理后分別加入4 μg 0.9%的氯化鈉溶液、pcDNA3.1-miR-34、miR-34siRNA，電擊處理后室溫環境下存放120 min，將各組細胞加入6孔、96孔培養板中，置于培養箱內進行培養取出后加入含800 μg/ml G418的培養基再次培養。

1.2.3 細胞增殖檢測:MTT法檢測3組細胞增殖能力。將3組細胞加入96孔板中，分別于12、24、48、72 h 后再每孔中加入30 μl的MTT液，37℃孵育4 h，棄培養液，加入150 μl的DMSO，酶標儀在498波長處檢測每孔的OD值。

1.2.4 TUNEL法檢測細胞凋亡情況:常溫環境中使用20 μg/ml蛋白酶K培養0.5 h后去除蛋白，使用PBS緩沖液進行徹底清洗，之后將平衡緩沖液100 μl加入其中，室溫環境中平衡10 min，之后滴入TdT酶反應液100 μl，避光、室溫環境中孵育1 h，之后加入100 μl SSC溶液，常溫環境中靜置20 min后進行清洗3次，之后使用DAPI進行復染，避光培養10 min后再次進行浸洗，封片觀察。DAPI復染細胞核呈藍色，凋亡細胞細胞核呈綠色，取每切片3視野進行觀察、計算細胞凋亡率，計算平均值。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期分布：將3組細胞以1×105個細胞/孔接種于6孔板，并將其置于5% CO2、37℃環境中培養，之后添加0.25%胰蛋白酶進行消化，離心處理10 min，離心轉通2 000 r/min，使用PBS緩沖液進行清洗，再次離心處理，之后添加1 ml PI染液，置于常溫、避光環境60 min，進行特異熒光標記后按照流式細胞儀操作方法檢測細胞周期分布。

1.2.6 細胞侵襲情況:使用Transwell小室實驗檢測。2 h前濕化小室。上室加入細胞懸液200 μl，在下室加入含10%胎牛血清的細胞培養液，在培養箱中培養24 h。用PBS沖洗2次后置于4%多聚甲醛中30 min。結晶紫染色15 min，染色后放在顯微鏡下觀察計數。

1.2.7 細胞遷移情況:使用細胞劃痕實驗檢測。將細胞使用胰酶消化制成細胞懸液，接種于6孔板。使用10槍尖垂直于孔板底部畫直線，PBS緩沖液清洗 3次。常溫培養24 h拍照計算劃痕。

1.2.8 Western blot法檢測Bcl-2、Bax、caspase3、E-cadherin、N-cadherin表達:使用PBS緩沖液對標本沖洗之后裂解30 min，測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質，添加蛋白緩沖液后進行電泳，10 min后將電轉膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環境下封閉90 min。之后結合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST液沖洗，結合二抗，60 min后清洗、顯色，對Bcl-2、Bax、caspase3、E-cadherin、N-cadherin相對表達量進行檢測。

2 結果

2.1 3組細胞增殖率、凋亡率比較 在24、48、72 h，上調miR-34組細胞增殖率均低于空白組，凋亡率均高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)；下調miR-34組細胞增殖率均高于空白組、上調組，凋亡率均低于空白組、上調組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組細胞增殖率、凋亡率比較

2.2 3組細胞周期分布情況比較 上調miR-34組處在G1、S、G2期的細胞比例均低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)；且下調miR-34組細胞比例均高于空白組、上調miR-34組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組細胞周期分布情況比較

2.3 3組細胞侵襲、遷移能力比較 上調miR-34組細胞侵襲細胞數、遷移細胞數均低于于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)；下調miR-34組細胞侵襲細胞數、遷移細胞數均高于空白組、上調miR-34組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖1、2。

表3 3組細胞侵襲、遷移能力比較 個,

空白組 上調miR-34組 下調miR-34組

空白組 上調miR-34組 下調miR-34組

2.4 3組細胞Bcl-2、Bax、caspase3相對表達量比較 上調miR-34組細胞Bcl-2相對表達量低于空白組，Bax、caspase3相對表達量高于空白組，且下調miR-34組細胞Bcl-2相對表達量高于空白組、上調miR-34組，Bax、caspase3相對表達量均高于空白組、上調miR-34組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組細胞Bcl-2、Bax、caspase3相對表達量比較

2.5 3組細胞MMP-9、ICAM-1相對表達量比較 上調miR-34組細胞E-cadherin、N-cadherin相對表達量均低于空白組，且下調miR-34組細胞E-cadherin、N-cadherin相對表達量均高于空白組、上調miR-34組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 3組細胞E-cadherin、N-cadherin相對表達量比較

3 討論

無限增殖、易轉移是癌細胞的兩大基本特征，抑制癌細胞增殖和轉移是治療癌癥的關鍵[6]。近年來，隨著對miRNA的不斷認識，對癌細胞有抑制作用的miRNA越來越多[7]。有學者在研究中表示，miR-34可通過多種轉錄因子和靶基因來調控口腔癌細胞的增殖、侵襲和凋亡[8,9]。本文研究中通過上調miR-34對口腔癌細胞增殖、凋亡能力及周期分布進行研究。結果顯示miR-34對口腔癌細胞有良好的抑制作用。

有學者在研究中表示，癌細胞的增值和凋亡失衡是腫瘤發生和發展的重要原因[10]。口腔癌癌細胞的增長率高于凋亡率，所以抑制口腔癌細胞的增殖、促進癌細胞凋亡對口腔癌的治療有重大意義[11,12]。本文研究結果顯示，上調miR-34的口腔癌細胞增殖率相對較低、凋亡率相對較高，這說明上調miR-34能夠有效抑制口腔癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡，從而抑制口腔癌細胞的增殖與發展。

有學者在研究中表示，正常細胞中miR-34發揮促進細胞衰老、誘導細胞凋亡使細胞周期阻滯在G1期的作用[13]。本文研究結果顯示，上調miR-34的口腔癌細胞在G1、S、G2期的細胞比例均較低，這說明上調miR-34表達量能夠阻滯口腔癌細胞周期分布，從而抑制宮頸癌細胞的進一步發展。

有學者在研究中表示，癌細胞的侵襲和遷移是臨床治療失敗的重要原因之一[14]。癌癥患者約有80%是死于癌細胞的侵襲和遷移，所以控制癌細胞的侵襲和遷移，對治療口腔癌有重要意義[15]。本文研究結果顯示，上調miR-34的口腔癌細胞侵襲、遷移細胞數相對較少，說明上調miR-34表達表達量能夠抑制口腔癌細胞的侵襲、遷移。

有學者在研究中表示，線粒體功能的變化是細胞凋亡的主要特征[16]。Bcl-2和Bax是線粒體通路中的核心蛋白，Bcl-2有調節線粒體通道的作用，Bax可通過升高線粒體膜通透性釋放細胞色素C誘導癌細胞凋亡，caspase3可直接作為凋亡的效應分子，是細胞凋亡的關鍵蛋白，具有使細胞DNA片段化從而導致細胞凋亡的作用[17]。本文研究結果顯示，上調miR-34后可使Bcl-2表達量下降，Bax、caspase3表達量上升。這說明上調miR-34可使促凋亡細胞上升，激活caspase3活性，促使癌細胞凋亡。

有學者在研究中表示，E-cadherin活性受抑制是促進癌細胞侵襲和轉移的重要原因之一[17]。E-cadherin可通過穩定細胞間的連接來阻止癌細胞的侵蝕與轉移[18]。N-cadherin可增強癌細胞與間質和內皮的粘附力，促進癌細胞的侵襲和轉移[19]。本文研究結果顯示，上調miR-34后N-cadherin表達量下降，E-cadherin表達量上升。這說明上調miR-34可調節E-cadherin、N-cadherin表達量，抑制口腔癌細胞的侵襲和轉移。

綜上所述，通過上調miR-34可促進口腔癌細胞凋亡、抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，調控癌細胞周期分布，調節Bcl-2、Bax、caspase3、E-cadherin、N-cadherin相對表達量，為臨床治療口腔癌提供一定的參考依據。