CA125與E-cadherin在復發性流產患者血清與組織中的表達及關系研究

關英霞 蔣蕾 尹潔 馬靜 史麗

復發性流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)目前仍是亟待解決的婦產科難題，因病因錯綜復雜導致治療難度增加。大多數專家認為，連續發生2次流產即應重視并予評估，因其再次出現流產的風險與3次者相近，它在育齡期女性中常見[1]。研究表明，RSA已知的主要病因有染色體異常、生殖道解剖異常、內分泌異常、免疫功能異常、感染性因素、血栓性因素及外部環境因素等[2]。目前仍有近半數的RSA病因未明確，因此需要更深入地研究復發性流產的發病原因，以期獲得合理有效的診治方案。有研究表明，CA125可作為先兆流產評估、子宮內膜異位癥及腫瘤的標記物[3,4]。E-cadherin是參與細胞-細胞間、細胞-基質間粘附作用的細胞因子，其與復發性流產的發病相關[5,6]。本研究旨在探討CA125與E-cadherin在復發性流產中的表達情況及相互關系，以期獲得兩者在復發性流產診斷及治療中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年11月至2019年11月于河北醫科大學第四醫院婦產科因復發性流產行清宮術的患者50例為試驗組，同期正常妊娠行人工流產術的患者50例為對照組。本研究獲得了河北醫科大學第四醫院的倫理委員會批準(倫理號：2016MEC122)。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①研究對象均身體健康，近期未服用激素類藥物，無不良生活習慣，無其他遺傳病史。②復發性流產組病例納入標準：≥2次流產史，超聲無明顯解剖結構異常，此次經B超聯合人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)檢測確認胚胎發育停止行清宮術，超聲結果提示無生殖系統畸形，術后絨毛組織常規行低深度全基因組高通量測序法排除因染色體異常導致流產。③選擇同期正常妊娠要求終止的50例為對照組，對照組病例納入標準：經B超檢查胚胎發育正常的健康孕婦，超聲結果提示無生殖系統畸形。

1.2.2 排除標準：①生殖道畸形；②合并代謝異常或免疫系統障礙；③術后低深度全基因組高通量測序法驗證因染色體異常。

1.3 試劑與儀器 CA125抗體和E-cadherin抗體，Entrez Gene:207，購自博奧森生物技術有限公司(北京，中國)。二抗羊源抗兔抗體，購自博奧森生物技術有限公司(北京，中國)。DAB顯色系統購自Sigma公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品預處理:用于血清學檢測對象均于術前取空腹肘靜脈血3 ml，靜置1 h后以1 500 r/min離心取上清，-20℃保存備用。在收集相應的蛻膜組織后經洗滌、脫水、固定等步驟，最后進行常規石蠟包埋制成厚度5～8 μm的標本。

1.4.2 CA125和E-cadherin采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測：實驗操作嚴格按說明書進行，每份標本做兩個平行孔，且所有標本均在同一批內檢測。采用2960型全自動酶標儀(Metertechinc)測定。

1.4.3 免疫組化檢測CA125和E-cadherin的表達:①組織包埋、脫蠟、切片：將預先包埋好的蛻膜組織切片，烤片，二甲苯替代品脫蠟，再用多濃度梯度下降的乙醇溶液水化，蒸餾水洗滌。②組織修復：用檸檬酸緩沖液微波修復抗原，PBS溶液洗滌2次。③抗體孵育：37℃BSA封閉蛋白30 min，滴加一抗4℃過夜孵育，PBS溶液洗滌2次，再滴加對應的二抗37℃，孵育1 h，PBS溶液洗滌2次。DAB顯色，蘇木素復染，反藍，脫水，透明，封片。再在Nikon 80i顯微鏡(日本)下觀察結果。

1.4.4 免疫組化評價標準:CA125和E-cadherin蛋白表達水平的陽性結果判讀：細胞漿或胞膜上呈現棕黃色，以顯微鏡下觀察陽性細胞百分率和顏色深度進行綜合評分，即總體百分率≤10% 為(-)；11%～25%為(+)；26%～50%為(++)；>50%為(+++)。結果由兩名具有相關經驗的人員進行評分并取均值，差異性大的評分進行2次復核，最終確定其評分。

1.5 觀察指標 觀察2組患者年齡、體重指數、妊娠時間(d)、血紅蛋白數、孕次、產次、痛經、是否輔助生殖。其中痛經依靠患者主訴。詢問并查閱患者是否輔助生殖，內容包括人工授精和試管。

2 結果

2.1 復發性流產與臨床資料的相關性分析 2組臨床資料比較：年齡、體重指數、痛經、輔助生殖差異有統計學意義(P<0.05)；妊娠時間、血紅蛋白數、孕次、產次差異無統計學意義(P>0.05)。復發性流產與年齡、體重指數、痛經、輔助生殖相關，與妊娠時間、血紅蛋白數、白細胞數、孕次、產次不相關。見表1。

表1 一般臨床資料比較 n=50

2.2 CA125、E-cadherin在復發性流產和正常妊娠患者血清中的表達 復發性流產患者血清中CA125表達水平明顯高于正常妊娠組，差異有統計學意義(P<0.05)；血清中E-cadherin表達水平在2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 CA125、E-cadherin在正常妊娠和復發性流產患者血清中的表達情況

2.3 CA125在復發性流產和正常妊娠患者蛻膜組織中的表達情況 CA125主要表達于蛻膜細胞漿或胞膜上，呈現棕黃色。在50例復發性流產蛻膜組織中表達水平明顯高于正常妊娠組，2組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表3，圖1。

表3 CA125在正常妊娠和復發性流產蛻膜組織中的表達情況 n=50,例(%)

低表達 中表達 高表達

2.4 E-cadherin在復發性流產和正常妊娠患者蛻膜組織中的表達情況 E-cadherin主要表達于蛻膜細胞漿或胞膜上，呈現棕黃色。在50例復發性流產患者蛻膜組織中的表達水平明顯低于正常妊娠組，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 E-cadherin在正常妊娠和復發性流產患者蛻膜組織中的表達情況 n=50,例(%)

低表達 中表達 高表達

2.5 CA125和E-cadherin在復發性流產患者蛻膜組織中表達的相關性分析 CA125在復發性流產蛻膜組織中呈高表達，而E-cadherin呈低表達，兩者有明顯負相關(r=-0.325，P=0.021)。見圖3。

圖3 在復發性流產患者蛻膜組織中CA125和E-cadherin的表達水平呈負相關

3 討論

近年來，復發性流產呈現出了逐年上升的趨勢[7]，因其病因錯綜復雜，目前仍有近50%病例病因未明。本研究所選復發流產病例排除染色體異常及生殖道解剖異常。臨床資料結果表明，復發性流產病例的年齡高于對照組，說明除高齡女性所致卵巢功能減退、卵子質量下降易出現胚胎染色體異常外，年齡仍然與復發性流產相關，可能是復發流產的高危因素。而BMI增高是現今大部分復發流產患者所面臨的問題，因肥胖會影響內分泌、正常受精、胚胎著床穩定性等。有研究表明，孕前減脂可提高懷孕幾率并有助于得到良好妊娠結局[8,9]。本研究發現復發性流產與痛經的發生具有一定的相關性，痛經為子宮內膜異位癥的典型臨床表現，本課題所研究的CA125及E-cadherin在內異癥中存在明顯異常表達[3,6]，有報道復發性流產可能與子宮內膜異位癥導致的內膜容受性下降有一定關系。對于行輔助生殖的女性，IVF-ET低雌激素水平可能影響胚胎著床發育，使得發生復發性流產的風險增加[10]。胚胎發育過程中，胎盤作為母胎之間的重要介質尤為關鍵，本課題重點研究母體血清學免疫指標及母胎界面免疫指標異常所導致的復發性流產，以期尋找發病機制及治療方向。

CA125是一種來源于體腔上皮、生殖道黏膜與卵巢的腫瘤抗原標志物，目前在婦產科被廣泛應用，用于診斷卵巢上皮性腫瘤、子宮內膜異位癥等疾病[11]。有研究表明，CA125存在于胎兒絨毛膜、羊水及母體蛻膜中[12]，這也可能是部分患者妊娠過程中CA125輕度升高的原因。目前有研究發現，當發生先兆流產時，母體血清CA125水平較升高，血清CA125水平可進一步用來預測先兆流產的發生[13]。本研究結果顯示，復發性流產患者血清及蛻膜組織中CA125水平均明顯高于正常妊娠患者，表明CA125同樣參與了復發性流產的發生，可作為評估復發性流產患者的指標，這可能與流產時蛻膜細胞破壞，CA125漏出于細胞外，并隨血液循環進入母體從而使患者血清CA125水平升高有關。

E-cadherin是一種 Ca2+依賴黏附分子，是一種跨膜鈣依賴型細胞-細胞粘附分子，其表達的缺失是上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)最重要的標志性變化。E-cadherin廣泛在各類上皮細胞中表達，在上皮細胞、組織形成和腫瘤抑制中發揮關鍵作用[14]。有動物實驗表明，在小鼠中發現E-cadherin在著床胚胎和子宮上皮細胞中均有表達，并隨著妊娠天數的增加呈現出逐漸降低的趨勢[15]。Bellati等[16]進行的回顧性研究表明非孕期子宮內膜組織低表達E-cadherin與不孕與復發性流產發病相關，本研究結果顯示復發性流產患者蛻膜組織中E-cadherin較正常妊娠組織中表達降低，說明復發性流產患者蛻膜組織中E-cadherin表達不足從而導致的蛻膜細胞生長、浸潤能力下降，與以往文獻報道[17,18]一致，同時本研究結果發現，低表達E-cadherin并未反應致患者血清中，可能與其在正常組織含量較低并在復發性流產組織中呈低表達相關。

朱啟全等[19]指出E-cadherin在乳腺癌癌組織中的表達減少而CA125異常升高，是導致癌細胞更容易發生浸潤和轉移的因素。腫瘤發生轉移的關鍵是通過上皮-間質轉化(EMT)來實現，EMT程序的活化使得細胞膜上的E-cadherin表達降低[20]，根據這一原理可以推測，CA125是否也可以通過調節蛻膜組織中E-cadherin的表達而參與復發性流產過程的發生。因此，本研究觀察了復發性流產的蛻膜組織中CA125與E-cadherin的表達，并分析了兩者的相關性。結果顯示復發性流產的蛻膜組織中高表達CA125與低表達E-cadherin呈負相關，說明CA125可以通過降低E-cadherin的表達而促進復發性流產的發生。Wnt/β-catenin信號通路活化后可上調ZEB1的表達，而后者是E-cadherin基因啟動子，抑制E-cadherin的表達[21]；Peinado等[22]指出NF-κB/p65可直接與Snail啟動子的某個區域結合，激活Snail的轉錄，從而直接抑制E-cadherin的表達。而CA125均可激活上述信號通路而發揮作用[23-25]，因此我們認為CA125與E-cadherin關系密切，CA125可通過多種信號通路調控E-cadherin的轉錄和表達，從而參與復發性流產的發生及發展。下一步，我們將對其具體的分子機制進性研究。

綜上所述，CA125在復發性流產患者血清及蛻膜組織中高表達，并且與E-cadherin的低表達呈負相關，說明CA125參與了復發性流產的發生，而其作用機制與調控E-cadherin表達有關，為復發性流產的發病機制體提供了新的思路和理論依據，為其診斷及治療提供了新的方向。