濃縮生長(zhǎng)因子和根管沖洗液對(duì)牙髓細(xì)胞的保護(hù)及貼附作用

殷亮亮 李春年

牙髓是位于牙髓腔內(nèi)的疏松結(jié)締組織，因此牙髓一旦受到微生物的感染，易引發(fā)牙髓根尖周病，對(duì)牙根未發(fā)育完成的年輕恒牙，臨床上傳統(tǒng)治療方法是根尖誘導(dǎo)成形術(shù)和根尖屏障術(shù)[1]。但二者都不能使牙根繼續(xù)發(fā)育，往往造成冠根比例失調(diào)，根管壁薄弱等不良預(yù)后。隨著組織工程、生物材料的發(fā)展以及牙髓干細(xì)胞的成功培養(yǎng)，牙髓血運(yùn)重建技術(shù)已成為恒牙發(fā)生牙髓病、根尖周疾病后的理想治療方法。支架是牙髓組織工程重要的組成部分，濃縮生長(zhǎng)因子(CGF)是第三代血小板聚集物，與前兩代血小板濃縮制品相比，CGF具有更好的再生能力和多功能性[2-5]。牙髓再生治療的根管化學(xué)預(yù)備與常規(guī)根管不同，使用沖洗液時(shí)不僅要考慮到其殺菌作用，還應(yīng)注意減小沖洗液的細(xì)胞毒性，保護(hù)進(jìn)入根管中的干細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)注意沖洗對(duì)根管壁釋放生長(zhǎng)因子的影響。目前臨床上常用的根管沖洗劑包括抗菌劑次氯酸鈉、氯己定以及金屬螯合劑EDTA等。因此，通過本研究觀察CGF對(duì)于牙髓細(xì)胞增殖和分化的作用，探索CGF在牙髓血運(yùn)重建術(shù)中的作用，并探究使用不同的根管沖洗液處理根管的效果，觀察沖洗后的根管對(duì)牙髓細(xì)胞貼附根管壁的影響，以期對(duì)提高牙髓血運(yùn)重建術(shù)的預(yù)后有積極的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 口腔頜面外科門診因正畸需要拔出的前磨牙或智齒。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡為14～18歲，未做過充填治療和牙髓治療，無齲壞，無根裂。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；超凈工作臺(tái)，Thermo Eleetron公司倒置相差顯微鏡，德國(guó)ZEISS公司；Synergy-TH酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotech公司；低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；YP2001N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；高壓蒸汽滅菌器，日本松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社。

1.2.2 主要實(shí)驗(yàn)器材：25 cm2培養(yǎng)瓶，ThermoFisher，美國(guó)；75 cm2培養(yǎng)瓶，ThermoFisher，美國(guó)；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó)Corning公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó)Corning公司。

1.2.3 主要試劑：胎牛血清，以色列BI公司；高糖DMEM培養(yǎng)液，美國(guó)Gibico公司；青、鏈霉素混合液，以色列BI公司；胰蛋白酶，美國(guó)Gibico公司；PBS磷酸鹽緩沖液，以色列BI公司；CCK-8試劑盒，中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒，中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；次氯酸鈉，朗力生物醫(yī)藥有限公司；17%EDTA溶液，朗力生物醫(yī)藥有限公司；0.2%氯己定，朗力生物醫(yī)藥有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 離體牙取材:牙齒拔除后自根尖部至冠部碘伏消毒3遍，高速手機(jī)和無菌水冷卻在牙頸部制備環(huán)形溝槽，不能穿髓，制備完成后將離體牙立刻置于預(yù)冷的含有1%雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，1 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室對(duì)牙髓組織取材，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3.2 牙髓細(xì)胞培養(yǎng):將收集的離體牙用含有2%雙抗(200 g/ml青霉素和200 g/ml鏈霉素)的PBS溶液清洗3遍，用技工剪沿著牙頸部預(yù)磨好的凹槽剪斷，拔髓針取出牙髓后剪去根尖區(qū)2 mm的牙髓，剩余的牙髓組織用含1%雙抗PBS溶液清洗3遍，將清洗干凈的牙髓組織用無菌眼科剪剪碎，使組織塊體積約為 0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小，移入15 ml離心管中，加入1 ml的Ⅰ型膠原酶(3 g/L)和中性蛋白酶(4 g/L),置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，消化約40 min，每隔15 min吹打組織塊，使組織塊與酶充分接觸，直到組織塊消化為棉絮狀，然后加入3 ml含10%FBS的培養(yǎng)液終止消化，并進(jìn)行吹打，充分接觸。將離心機(jī)設(shè)置為1 000 r/min，離心5 min，去除上清液，加入3 ml的含10%FBS的培養(yǎng)液重懸，將懸液接種于8 cm2培養(yǎng)皿中，在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。

1.3.3 牙髓細(xì)胞的傳代:在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞外形及細(xì)胞狀態(tài)，原代牙髓細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，可進(jìn)行傳代。在超凈工作臺(tái)下用1%雙抗PBS蕩洗培養(yǎng)皿3遍,清洗力度要輕柔，防止細(xì)胞損傷。然后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，溶液量要達(dá)到與培養(yǎng)皿底細(xì)胞充分接觸，在37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 min，在顯微鏡下及時(shí)觀察，當(dāng)貼壁細(xì)胞趨于圓形、細(xì)胞開始少量飄起時(shí)，加入2～3倍胰蛋白酶溶液體積的完全培養(yǎng)基終止消化。用巴氏吸管將皿底的細(xì)胞充分吹打，使細(xì)胞從皿底脫壁，移入離心管中，將離心機(jī)設(shè)置為1 000 r/min，離心5 min，去除上清液，加入3 ml的含10%FBS的培養(yǎng)液重懸，按1∶2或1∶3進(jìn)行傳代，加入適量培養(yǎng)液，混勻后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液，之后每3天換液，牙髓細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，進(jìn)行下一次傳代。

1.3.4 CGF的制備:①采血：采集7～8 ml血液，注入不含添加劑的真空試管中，避免搖晃以免發(fā)生溶血反應(yīng)。②離心:配平后立即將試管和配平試管對(duì)稱放置于Medifuge離心機(jī)中，選擇CGF制備程序，差速離心13 min，具體離心過程如下：加速30 s；2 700 r/min，2 min；2 400 r/min，4 min；2 700 r/min，4 min；3 000 r/min，3 min；減速36 s到停止?fàn)顟B(tài)。按程序離心一定時(shí)間后，再靜置10 min使分層更穩(wěn)定。試管中血液標(biāo)本分為三層，最上層為淡黃色血清，中間層為纖維蛋白層(即濃縮生長(zhǎng)因子CGF)、底層為富血小板凝固層(含紅細(xì)胞和血小板)。③分離CGF塊:過濾血清并修剪富血小板凝固層，保留少量血漿層，獲得濃縮生長(zhǎng)因子塊狀標(biāo)本。④制備CGF膜:將分離出來的塊狀濃縮生長(zhǎng)因子壓制成膜狀濃縮生長(zhǎng)因子。無菌眼科剪修剪CGF膜至3 mm×3 mm大小置于無菌0.9%氯化鈉溶液中備用。

1.4 CGF對(duì)牙髓細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)分為1個(gè)對(duì)照組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組不加CGF，實(shí)驗(yàn)組分別加入1、2、3片CGF纖維蛋白膜，使實(shí)驗(yàn)組分為低濃度組、中濃度組、高濃度組。取第4代牙髓細(xì)胞懸液調(diào)整至合適密度，接種于6孔板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，使細(xì)胞貼壁，在實(shí)驗(yàn)組樣本孔內(nèi)分別加入相應(yīng)的CGF和培養(yǎng)液，對(duì)照組僅加入含10%FBS的培養(yǎng)液，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加液量為2.5 ml，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換1次液，分別于第3、5、7天吸去原培養(yǎng)液，PBS清洗3遍后，0.25%胰蛋白酶溶液消化，每孔加入3 ml 含10%FBS DMEM培養(yǎng)液,取600 μl/孔細(xì)胞懸液與600 μl正常培養(yǎng)液混勻，以200 μl/孔細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，吸去原培養(yǎng)液，加入100 μl 含10%FBS DMEM培養(yǎng)液和10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2～4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)的OD值。相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次。

1.5 CGF對(duì)牙髓細(xì)胞分化的影響 取生長(zhǎng)良好的第4代細(xì)胞，制備密度合適的細(xì)胞懸液接種至12孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，使細(xì)胞貼壁，吸去原培養(yǎng)液，PBS清洗3遍，按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)的CGF和培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每3天換液，分別在第3、5、7天終止培養(yǎng)，取樣檢測(cè)；吸去培養(yǎng)液，PBS清洗3遍，加入250 μl/孔R(shí)IPA裂解液，同時(shí)反復(fù)吹打，提取細(xì)胞蛋白。根據(jù)ALP試劑盒說明書，按照不同分組分別將蛋白樣品加入96孔板內(nèi)，每孔30 μl，再分別加入基質(zhì)液和緩沖液各50 μl，37℃孵育15 min，加入顯色劑150 μl，酶標(biāo)儀檢測(cè)在520 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(OD值)。相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次。

1.6 不同的根管沖洗液處理根管后對(duì)牙髓細(xì)胞貼附根管壁的影響 高速金剛砂車針將收集的因正畸拔除的下頜離體前磨牙開髓，拔髓，在釉牙骨質(zhì)界處用金剛砂盤去牙冠，保留牙根，分為3組，分別用次氯酸鈉、氯己定、EDTA沖洗，金剛砂盤縱向剖開離體牙牙根，暴露根管壁，截成1 mm×1.5 mm×1.5 mm大小的牙本質(zhì)片，備用。將實(shí)驗(yàn)分為次氯酸鈉組、CHX組、EDTA組。將3組牙本質(zhì)塊用75%乙醇浸泡15 min，PBS沖洗3遍，放置于96孔板中。選用第4代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的牙髓細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后制取細(xì)胞懸液，以2×104個(gè)/ml密度接種至96孔板內(nèi)，每孔200 μl。培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，吸去孔中培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，每孔加入100 μl培養(yǎng)液和10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2～4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)的OD值。相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 牙髓細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，用改良組織塊酶消化法進(jìn)行原代牙髓細(xì)胞培養(yǎng)，原代培養(yǎng)第3天，可見牙髓細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，成放射狀，原代細(xì)胞培養(yǎng)第14天左右基本長(zhǎng)滿，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，纖維狀。細(xì)胞數(shù)量較多時(shí)呈放射狀或旋渦狀，生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)可進(jìn)行傳代。見圖1～3。

圖1 人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)第3天(倒置顯微鏡×200) 圖2 人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)第7天(倒置顯微鏡×200) 圖3 人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)第7天(倒置顯微鏡×200)

2.2 CGF對(duì)牙髓細(xì)胞增殖的作用 CCK-8檢測(cè)OD值，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，CGF能夠促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖，并隨時(shí)間延長(zhǎng)和CGF劑量的增加牙髓細(xì)胞的增殖能力也增強(qiáng)。第3天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組牙髓細(xì)胞的增殖作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第5、7天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖4。

表1 隨著時(shí)間變化不同濃度的CGF作用于牙髓細(xì)胞的CCK-8值 OD值，

圖4 CCK-8檢測(cè)不同濃度CGF對(duì)牙髓細(xì)胞的增殖作用(a:P<0.05)

2.3 CGF對(duì)牙髓細(xì)胞分化的影響 ALP試劑盒檢測(cè)在第7天時(shí)CGF組中牙髓細(xì)胞的堿性磷酸酶活性高于對(duì)照組，并且高濃度CGF組的堿性磷酸酶活性最高，吸光度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 隨著時(shí)間變化不同濃度的CGF作用于牙髓細(xì)胞的ALP值 OD值，

2.4 根管沖洗液對(duì)牙髓細(xì)胞貼附根管壁的影響 牙髓細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光度值，結(jié)果顯示次氯酸鈉組吸光度值大于其他2組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 根管沖洗液對(duì)牙髓細(xì)胞貼附的吸光度值 OD值，

3 討論

在牙組織工程和再生的各種細(xì)胞類型中，牙髓組織中的干細(xì)胞被認(rèn)為是理想的細(xì)胞類型[6-8]。牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells，DPSCs)除了干細(xì)胞的2個(gè)主要特征(自我更新和多向分化)外，牙髓細(xì)胞在組織工程中的應(yīng)用還具有其他一些優(yōu)點(diǎn)[9,10]：(1)這些細(xì)胞收集容易，免疫排斥低；(2)從牙髓組織中提取效率高；(3)可塑性強(qiáng)、不涉及倫理問題；(4)它們與生物材料的相互作用已經(jīng)被證明[11]。目前，牙髓細(xì)胞培養(yǎng)的方法主要有酶消化法，組織塊法和改良組織塊酶消化法。酶消化法與組織塊法這2種不同的培養(yǎng)方法會(huì)導(dǎo)致牙髓細(xì)胞在形態(tài)和生長(zhǎng)速度上存在差異，酶消化法能產(chǎn)生更有增殖潛力的牙髓細(xì)胞并將所有的細(xì)胞從組織中釋放出來，然而不可避免地會(huì)造成一定程度的細(xì)胞損傷和數(shù)量損失。組織塊法需要2周左右的時(shí)間才能從組織中遷移出足夠數(shù)量的細(xì)胞，增加了污染機(jī)率。本實(shí)驗(yàn)采用改良組織塊酶消化法分離培養(yǎng)原代牙髓細(xì)胞，綜合了酶消化法與組織塊法的優(yōu)點(diǎn)，顯著縮短了酶消化時(shí)間，提高了細(xì)胞存活率。

CGF是在2006年首次研制成功的第3代濃縮血小板，通過特殊的離心程序，CGF具有更高的強(qiáng)度和黏度[12]，可以更好地保護(hù)生長(zhǎng)因子不被蛋白水解[13,14]。CGF作為組織工程的生物支架材料具有多種纖維蛋白交織而成的三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，DPCs可以被嵌入支架中以分化成功能性的成牙本質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞增殖和分化是組織修復(fù)和再生的關(guān)鍵因素。CGF富含多種生長(zhǎng)因子，如血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)、類胰島素生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors，IGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors,FGFs)等[15-17]。這些生長(zhǎng)因子通過細(xì)胞歸巢誘導(dǎo)DPCs增殖、分化、遷移并黏附在損傷部位，以取代缺失的成牙本質(zhì)細(xì)胞。CGF的生長(zhǎng)因子多樣性比單個(gè)生物活性蛋白或生物蛋白制劑效果更加理想。本研究采用不同濃度的CGF膜培養(yǎng)DPCs，更貼近于臨床應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)的結(jié)論是CGF逐漸促進(jìn)了DPCs的增殖和遷移，并與濃度呈正相關(guān)。這可能是由于CGF的特殊三維結(jié)構(gòu)的作用，使生長(zhǎng)因子可以維持并緩慢釋放，延長(zhǎng)生長(zhǎng)因子的作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖。ALP被認(rèn)為是在骨形成過程中起關(guān)鍵作用的典型成骨標(biāo)志物，并與早期細(xì)胞的成骨分化有關(guān)。在本研究中，我們觀察到第7天時(shí)CGF顯著增加了ALP活性。BMP2/SMAD5/Runx2信號(hào)通路是與骨重建和骨形成相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路，提示CGF可能是通過上調(diào)BMP2、SMAD5和Runx2的蛋白表達(dá)來促進(jìn)DPCs的礦化。

在實(shí)施牙髓血運(yùn)重建過程中，其成功的前提是徹底消毒根管系統(tǒng)。臨床上常用的根管沖洗劑包括次氯酸鈉、氯己定及金屬螯合劑EDTA等。在溶解壞死組織后，抗菌劑次氯酸鈉能更好地到達(dá)并清潔感染根管，暴露牙本質(zhì)的膠原纖維，增強(qiáng)宿主細(xì)胞在牙本質(zhì)上的生長(zhǎng)，為牙髓血運(yùn)重建術(shù)的成功實(shí)施奠定了基礎(chǔ)。氯己定能夠破壞細(xì)菌胞漿膜上的滲透屏障，具有相當(dāng)強(qiáng)的廣譜抗菌和殺菌作用，對(duì)于多數(shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有殺滅作用，因此用于根管沖洗消毒中。但氯己定的滲透作用差，不具有組織溶解能力，并且氯己定具有一定的細(xì)胞毒性，使用后如不進(jìn)行無菌0.9%氯化鈉溶液的再次沖洗，則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。EDTA的螯合作用可以有效的清除根管玷污層，但是如果長(zhǎng)時(shí)間的與根管壁接觸也會(huì)對(duì)牙本質(zhì)產(chǎn)生腐蝕作用。本實(shí)驗(yàn)觀察了次氯酸鈉、氯己定、EDTA處理根管后牙髓細(xì)胞貼附根管壁的情況，結(jié)果顯示由次氯酸鈉處理過的牙本質(zhì)塊CCK-8值大于其他2組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示在牙髓血運(yùn)重建術(shù)中次氯酸鈉可作為有效的根管沖洗劑。