肺癌侵襲轉移與外周血RASSF1A、SHOX2甲基化水平的相關性研究

唐華 唐際富 廖洪春 岑玉蘭 廖光付

肺癌是一種源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，是世界范圍內發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生命健康[1]。隨著近年來醫(yī)療水平的發(fā)展，盡管肺癌的治療方法有著很大改進，但其存活率仍無法明顯提高，而導致肺癌患者死亡的最主要原因是惡性腫瘤的侵襲和轉移[2]。因此，尋找與肺癌侵襲轉移相關的分子生物學標記物，可能對改善肺癌預后有重要意義。Ras相關區(qū)域家族蛋白1A(Ras-association domain family 1A，RASSF1A)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切聯系，是一種新型的抑癌基因，且RASSF1A是腫瘤中甲基化程度最高、最普遍的基因之一[3]。矮小同源盒基因2(short stature homobox 2，SHOX2)是同源盒基因家族的一員，可調控基因的表達和控制器官發(fā)生及細胞分化。研究表明，SHOX2是肺癌診斷時研究較多的甲基化指標[4]。已有肺泡灌洗液中RASSF1A、SHOX2基因甲基化檢測在肺癌診斷中的研究[5]，但關于外周血中二者甲基化水平與肺癌侵襲轉移相關性的研究較少。因此，本研究通過探討RASSF1A、SHOX2基因甲基化與肺癌侵襲轉移的關系，以期為肺癌基因治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2月至2017年5月于廣西科技大學第二附屬醫(yī)院就診的96例肺癌患者為肺癌組(經組織病理學確診)，其中男59例，女37例；年齡46～73歲，平均年齡(59.97±10.48)歲。同期選取114例健康體檢者作為對照組，其中男70例，女44例；年齡48～76歲，平均年齡(60.84±10.56)歲。2組年齡、性別比差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院臨床研究倫理委員會批準，均由專業(yè)人員詳細告知所有受試者研究內容，并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①經影像學檢查、臨床特征及病理證實確診為肺癌患者，肺癌患者符合診療規(guī)范[6]；②病歷資料齊全者；③年齡>18歲者；④術前未接受過放療、化療等輔助治療。

1.2.2 排除標準：①合并其他感染性疾病、嚴重肝功能異常或腎功能異常者；②有其他惡性腫瘤或惡性腫瘤史者；③有嚴重認知功能障礙或精神障礙者；④已參與其他臨床試驗或因其他原因不能參與試驗者。

1.3 主要試劑與儀器 DNA提取試劑盒(貨號：JL1545)，購自德國QIAGEN公司；CpGenome DNA Modification Kit(貨號：XY-S7821)，購自德國Merck Millipore公司；PTG19-T載體(貨號：WH0194-GDH)，購自北京百奧萊博科技有限公司；XL-10 Gold感受態(tài)細胞(貨號：KL1152)，購自上海康朗生物科技有限公司。PCR儀(型號：T100)，購自美國Bio-Rad公司。

1.4 研究方法

1.4.1 樣品采集及保存:對照組于體檢當天、肺癌患者于入院第2天采集清晨空腹外周靜脈血樣，加入乙二胺四乙酸二鉀充分抗凝，3 000 r/min離心15 min后收集血漿，置于-80℃保存待測。

1.4.2 血漿RASSF1A、SHOX2基因甲基化水平測定:亞硫酸氫鈉處理基因組DNA后采用直接測序法檢測RASSF1A、SHOX2基因甲基化水平。DNA抽提試劑盒提取血漿基因組DNA，紫外分光光度計檢測DNA純度，-20℃保存。采用亞硫酸氫鈉修飾試劑盒對DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。RASSF1A、SHOX2引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR擴增條件：95℃預變性6 min；94℃ 15 s，55℃ 30 s，75℃ 40 s，40個循環(huán)。PCR反應體系共50 μl：模板DNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，2×PCR Mix 25 μl，ddH2O 21 μl。目標片段割膠回收后連接，采用PTG19-T做載體，XL-10 Gold感受態(tài)進行轉化、復蘇、涂板，酶切法鑒定陽性菌落，上海生工生物工程股份有限公司測序，甲基化數據用BIQ Analyzer軟件分析和整理。見表1。

表1 PCR引物序列

1.5 統計學分析 應用SPSS 22.0統計軟件，計數資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，采用多因素COX回歸分析影響肺癌預后的因素，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組血漿RASSF1A、SHOX2基因甲基化陽性率比較 肺癌組血漿RASSF1A、SHOX2基因甲基化陽性率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組血漿RASSF1A、SHOX2基因甲基化陽性率比較 例(%)

2.2 肺癌患者血漿RASSF1A、SHOX2基因甲基化與臨床病理特征的關系 根據是否發(fā)生RASSF1A、SHOX2

基因甲基化，將96例肺癌患者分為RASSF1A非甲基化組38例，RASSF1A甲基化組58例；SHOX2非甲基化組34例，SHOX2甲基化組62例。RASSF1A、SHOX2基因甲基化與肺癌患者年齡、性別、吸煙情況、腫瘤大小、病理類型無關(P>0.05)，與肺癌患者組織分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關(P<0.05)。見表3。

表3 肺癌患者血漿RASSF1A、SHOX2基因甲基化與臨床病理特征的關系 例(%)

2.3 肺癌患者血漿RASSF1A、SHOX2基因甲基化與預后的關系 隨訪3年，根據隨訪期間肺癌患者生存情況，將其分為生存44例和死亡52例。RASSF1A、SHOX2基因甲基化與肺癌患者預后有關(P<0.05)，且RASSF1A、SHOX2甲基化組患者死亡比例高于RASSF1A、SHOX2非甲基化組。見表4。

表4 肺癌患者血漿RASSF1A、SHOX2基因甲基化與預后的關系 例(%)

2.4 影響肺癌預后的多因素COX回歸分析 將肺癌患者是否發(fā)生死亡作為因變量，以患者血漿SHOX2、RASSF1A基因甲基化、組織分化程度、淋巴結轉移、TNM分期為自變量進行分析，結果顯示，RASSF1A、SHOX2基因甲基化、TNM分期是影響肺癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響肺癌預后的多因素COX回歸分析

3 討論

近年來，肺癌發(fā)病率呈上升趨勢，且趨于年輕化，研究表明，絕大多數肺癌患者確診時已到癌癥中晚期，尤其對于確診時已發(fā)生遠處轉移且不能切除的肺癌患者，其治療較為困難，導致生存率很低[7]。研究發(fā)現，多種腫瘤均存在至少一個基因的啟動子發(fā)生高甲基化，DNA甲基化已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的研究熱點之一[8]。研究表明，肺癌的侵襲和轉移與基因啟動子甲基化密切相關[9]。

RASSF1A基因作為Ras激活信號通路中的負向調節(jié)基因，可能是參與細胞周期調控的重要抑制蛋白，通過多種途徑抑制細胞生長、促進細胞凋亡和衰老[10]。RASSF1A基因轉錄水平的表達與肺癌的TNM分期和淋巴結轉移存在明顯相關性，同時說明RASSF1A基因參與肺癌的發(fā)展進程，在其侵襲和轉移過程中可能發(fā)揮重要調控作用[11]。本研究結果顯示，肺癌患者血漿RASSF1A基因甲基化陽性率高于健康人群，與張洪彬等[12,13]研究結果相似，RASSF1A基因甲基化是影響肺癌患者死亡的獨立危險因素，且RASSF1A基因出現甲基化的死亡患者比例高于非甲基化。推測RASSF1A基因的特異性甲基化可能導致RASSF1A基因在肺癌中的表達失活，進而使得RASSF1A蛋白無法參與細胞周期的調控，導致腫瘤細胞生長迅速，同時發(fā)生肺癌的侵襲和轉移，肺癌患者病情加重，死亡概率增加。

研究表明，SHOX2基因甲基化已成為輔助肺癌診斷的生物標志物，其診斷有較高的特異性和敏感度，且在肺癌患者外周血、支氣管灌洗液、胸腔積液、腫瘤組織等標本中均能檢測到SHOX2基因甲基化[14]。本研究結果中肺癌患者血漿SHOX2基因甲基化陽性率高于健康人群；SHOX2基因甲基化是影響肺癌患者死亡的獨立危險因素，且SHOX2基因出現甲基化的死亡患者比例高于非甲基化。提示SHOX2基因甲基化水平可反映病情進展，隨著肺癌發(fā)生侵襲和轉移，惡性程度的增高，SHOX2基因甲基化水平增高，更易檢測[15]。此外，本研究結果中RASSF1A、SHOX2基因甲基化與肺癌患者組織分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關。進一步提示RASSF1A、SHOX2甲基化可能參與肺癌的侵襲轉移，且基因甲基化可能多發(fā)生于有淋巴結轉移的低分化肺癌。

綜上所述，RASSF1A、SHOX2基因甲基化水平與肺癌的侵襲轉移及預后有密切聯系，對基因甲基化的研究可能為今后尋找更多的治療新靶點和腫瘤分子生物學標記物起到積極的推動作用。然而本研究存在一定的不足之處，檢測甲基化過程中，采用亞硫酸氫鈉處理后，引物與模板發(fā)生錯配的概率增高，有可能會造成非特異性擴增。有待今后采用更先進的檢測技術、納入更多樣本進一步深入探究。