金槍魚加工副產物發酵液對植物的抗菌促生長活性

王一凡，王志高，易 沖，吳 越，張澤坤，王坤美，羅紅宇

(浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316022)

目前，全世界范圍內人們對海洋資源的開發不斷擴大，但是在對海產品的捕獲和加工中，大量低商業價值的原料和水產副產物未能得到充分利用，并且隨著漁業加工業的快速發展，水產加工副產物數量急劇增加[1]。例如，單在歐盟水產加工中產生的副產物數量估計為每年500 萬t，其中超過60%的副產物來自各種魚片、煙熏魚的加工，此外魚罐頭工業、甲殼類和軟體動物生產加工過程中，也有大量的廢棄物產生[2]。在中國，2019 年水產品產量達為6 450 萬t[3]，但其中只有40%用于加工，利用率低于50%[2]。目前國內對這些低值資源的處理有兩大問題，一是資源的浪費，蛋白質、礦物質和油脂等大量營養物質的利用不足，二是處理如此多的高污染有機物會造成嚴重的環境和經濟問題。因此，有效提高低值水產資源的利用率以及研發清潔環保處理技術和方法具有重要的意義。

此外，化肥和農藥的使用對植物的生長和環境都有非常大的影響，越來越多的人考慮將生物制劑用于農業生產中[4]。DAO,et al[5]使用1 個5 L 的帶狀反應器對水產廢棄物進行了大規模的生物降解，發現了土壤短芽孢桿菌Brevibacillus agri、蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus、2 種地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis、副短芽孢桿菌Bacillus parabrevis等5 種潛藏在的水產廢棄物中的降解菌，并將其轉化為液體肥料；KIM,et al[6]研究利用土壤短芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、兩種地衣芽孢桿菌和副短芽孢桿菌將魚類廢棄物進行發酵將其轉化為肥料；LEWER,et al[7]在刺糖多糖孢Saccharopolysporasp.的發酵過程中分離出發酵過程中產生的毒素，利用分離出來的毒素生產出多殺菌素殺蟲劑；JEMIL,et al[8]發現由斑馬藍蛋白水解物通過發酵得到的水解物中獲得抗菌活性與一種蛋白水解細菌(拮抗內生細菌A21)的抗菌活性一致。目前越來越多生物制劑被應用于農業生產中，本文將生物制劑運用到水產加工副產物中，探究發酵液對植物的抗菌促生長活性，可提高水產加工副產物的利用率，促進農業發展，實現現代化綠色生產。

生物肥料被譽為環保、低成本的產品，可以有效解決糧食生產過程中的不安全問題[9]。由于EM 菌(包含光合菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌類)在種植、畜牧等行業中的應用非常廣泛。本實驗課題組前期從低值水產品中分離的菌株(發酵菌株)和EM 菌同樣有發酵作用，為了探究EM 菌和發酵菌株代謝產生的活性物質的抗菌特性，利用瓊脂擴散法評價發酵液的抗菌活性，利用盆栽實驗初步評價發酵液的抗病害能力，并考察了發酵液抗菌活性的穩定性，為發酵菌活性代謝產物的分離純化和結構鑒定，進一步開發生物肥料奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 實驗原料

市售有機液肥家庭濃縮營養液(樣品A)、水產加工副產物(主要是金槍魚Thunnus albacores，含少量棘頭梅童魚Collichthys lucidus等加工副產物，包含魚頭、魚骨、內臟等)，由岱山縣綠康源海洋生物技術有限公司生產提供，將副產物粉碎至1 cm×1 cm 以內，裝入聚乙烯包裝袋于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.1.2 實驗菌株

發酵菌株：施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri、類芽孢桿菌Paenibacillussp、黑曲霉Aspergillus niger、季也蒙假絲酵母Candida guilliemondii、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis separated，本課題組從低值漁獲物和加工副產物中分離并進行了鑒定；EM 菌岱山綠康源海洋生物科技有限公司提供；抗菌活性測試菌株：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(批號：CMCC 10002)、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus(批號：CMCC 26003)、大腸桿菌Escherichia coli(批號：CGMCC 1.1100)、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa(批號：CMCC 10104)、傷寒沙門氏菌Salmonella typhus(批號：CGMCC 21483)、八疊球菌Sarcinasp.(批號：CMCC 1.258)購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)。瓜鏈格孢菌Alternaria cucumerina、齊整小核菌Sclerotium rolfsii、擬盤多毛孢Pestalotiopsissp.和核盤菌Sclerotinia sclerotiorum從腐敗水果蔬菜中分離鑒定。

1.1.3 化學試劑

NaOH；HCl；pH 8.0 緩沖液；茚三酮均為分析純國藥集團化學試劑有限公司。多菌靈購自舟山華潤萬家。

1.1.4 植物種子

甘藍型油菜種子購自舟山定海潔姬種子店。

1.1.5 設備

手提壓力蒸汽滅菌器(DSX-280KB24)，上海申安醫療器械廠；旋轉蒸發器(RE-52AA)，上海亞龍生化儀器廠；孵化器(DHP-9052)，一恒科學儀器有限公司；分光光度計(721G)，上海儀電分析儀器有限公司；水浴鍋(HHSII-1)，上海波迅工業有限公司；發酵罐(BioFlo-CelliGen115)，NBS 公司。

1.2 方法

1.2.1 ABFI 和ABFII 的制備

參照SONG Ru,et al[10]方法，ABFI 的制備選用活化后的EM 菌來發酵水產副產物制得。ABFII 的制備選用經篩選過后的發酵菌株(施氏假單胞菌、類芽孢桿菌、黑曲霉、季也蒙念珠菌、枯草芽孢桿菌)對水產副產物進行發酵制得。

1.2.2 抑菌活性測定

參照魏東東等[11]方法，采用瓊脂擴散法對發酵液(ABFI,ABFII)和樣品A 進行抗菌活性的研究。吸取100 μL 的被測真菌孢子懸浮液(106CFU·mL-1)接種在瓊脂平板上。吸取50 μL 不同濃度的ABFI、ABFII 和樣品A 溶液加入直徑為6 mm 孔中。將真菌培養皿在30 ℃下培養48 h；細菌培養皿在37 ℃下培養24 h，游標卡尺測量抑菌圈直徑。高濃度(HC)為樣品A、ABFI 和ABFII 初始濃度，低濃度(LC)是初始濃度的一半，通過稀釋一倍體積制得。

1.2.3 發酵液的穩定性

本實驗考察了發酵液抑菌活性對熱和酸堿的穩定性。選用具有抑制效果的致病菌，采用瓊脂擴散法，對不同pH 和不同溫度熱處理的ABFII 的抗菌活性進行了比較。在熱穩定性試驗中，將ABFII 分別在35、45、55、65、75、85 和95 ℃的水浴中加熱處理15～30 min，然后冷卻到室溫得到熱處理樣品。在pH 敏感性試驗中，用HCl (6 mol·L-1)和NaOH (6 mol·L-1)調整使ABFII 的pH 分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10，測定9 個樣品的抗菌活性。實驗設置3 組平行。

1.2.4 發酵液的化學成分分析

采用茚三酮顯色法[12]對ABFI 和ABFII 中的氨基酸進行定量測定，以精氨酸標準樣品為校準標準，計算氨基酸濃度。在0.005 4～0.064 0 mg·mL-1范圍內，獲得了良好的線性關系，回歸曲線為y=0.000 3 x-0.007 3(R2=0.992)，y 為570 nm 處吸光度，x 為氨基酸的濃度(mg·mL-1)，R2為相關系數。發酵液中蛋白質、脂肪、礦物質等均由北京Pony 譜尼測試集團有限公司測定。

1.2.5 盆栽實驗

為測試ABFII 作為液體肥料的潛在用途，實驗參照范瑛閣等[13]方法，以自來水為空白組，ABFII 為實驗組，商業殺蟲劑多菌靈為陽性對照組進行盆栽實驗，一周后測量蔬菜最大和最小葉片的長度和直徑。將自來水、ABFII 和1 g·mL-1的多菌靈噴灑100 mL 在斑點植物的葉子上，24 h 后，接種腐敗孢子擬盤多毛孢于葉片上使其受侵染。7 d 后，隨機采摘3 個組的葉片，放入30 mL 水的錐形瓶中攪拌1 h，從錐形瓶中吸取100 μL 溶液涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上。平板在30 ℃的恒溫培養箱中孵育2 d，觀察計數菌落的數量來評價各組抑菌效果。

1.2.6 統計學處理

每次實驗重復3 次采用SPSS 22.0 統計軟件進行方差分析的顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 發酵液抗菌活性評價

抗菌實驗結果顯示3 種發酵液的低濃度組和高濃度組對枯草芽孢桿菌、八疊球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌均無抑制作用。

圖1、2 分別是ABFI 和ABFII 對瓜鏈格孢菌，齊整小核菌，擬盤多毛孢和核盤菌的抗菌試驗。從表1中可以得出樣品A 和ABFI 對試驗病原菌的增殖沒有任何抑制作用，而ABFII 能不同程度地抑制瓜鏈格孢菌和擬盤多毛孢的增殖，其抑菌圈直徑在9～15 mm 之間。

表1 樣品A、ABFI、ABFII 的抗真菌實驗結果Tab.1 A sample,ABFI,and ABFIII antifungal spectrum

圖1 ABFI 抗真菌試驗(1-LC，2-HC)Fig.1 ABFI antifungal test (1-LC，2-HC)

圖2 ABFII 抗真菌試驗(1-LC，2-HC)Fig.2 ABFII antifungal test (1-LC，2-HC)

本實驗說明ABFII 在低高濃度時對所測瓜鏈格孢菌和擬盤多毛孢有明顯的抑制作用，濃度越高，抑制效果越明顯，同濃度下ABFII 對擬盤多毛孢的抑制更好。而ABFI 只有在高濃度時對瓜鏈格孢菌有抑制作用。擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌會讓植物得葉斑病，使葉肉組織枯死。SONG Ru[14-15]證實了半鰭鳳尾魚胃蛋白酶水解得到的產物具有很高的抗大腸桿菌的活性。RAJANBABU,et al[16]也報道了魚類分泌不同種類的天然肽，這些肽參與宿主的防御機制，用來防御由各種微生物引起的疾病，對革蘭氏陽性和陰性菌，真菌和病毒都有一定的抑制活性。PAN,et al[17]已經證明了從魚中提取的抗菌肽-1 對二倍體真菌(白色念球菌Candida albicans)的抗菌作用。許多文獻[14-18]證明海產品提取物有抗菌活性這和我們研究ABFII 對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌的抑制結果非常相似。然而，樣品A 和ABFI 對病原菌的增殖并沒有表現出顯著的抑制作用，但樣品A 的化學組成和ABFII 類似，所以目前樣品A 是被用作肥料而不是抗菌劑[19]。EM 菌中的放線菌和乳酸菌可以分解粗纖維等大分子物質，光合細菌可以利用太陽光并且可以吸附重金屬。所以常被應用在畜牧業[20-21]和污水處理[22]等方面。故ABFI 缺乏顯著的抗菌活性可能是由于水產副產物中能夠被EM菌發酵利用的部分較少，沒有得到大量有抑制活性的物質，也可能EM 菌發酵過程產生的物質能夠中和或變性其生物活性。

在3 種發酵方式中，只有ABFII 在低高濃度都對所測瓜鏈格孢菌和擬盤多毛孢有明顯的抑制作用，而ABFI 只有在高濃度時對瓜鏈格孢菌有抑制作用，從表4 數據中猜測可能是由于ABFI 中蛋白質含量較低，所以猜測抑菌成分與蛋白質有關，因此選擇抑菌效果較好的ABFII 測定其熱穩定性和pH 敏感性并進行盆栽試驗。

2.2 ABFII 的穩定性

為了確定發酵液ABFII 抑菌活性的穩定性，本文考察了不同溫度和pH 對其抑菌活性的影響。

2.2.1 ABFII 的pH 敏感性

室溫下測定了ABFII 在不同pH 下的抑菌穩定性。從表2 可以看出在pH 為3 和4 時ABFII 對擬盤多毛孢的抑制作用最強，抑制圈直徑為20 mm，在pH 為2、5 和6 時，也表現出較強的抑制效果，抑菌圈直徑為10～12 mm。ABFII 對瓜鏈格孢菌的抑制效果隨pH 的增大呈現出先增大后減小的趨勢，在pH 為3 時，抑制效果最強，抑制圈直徑為14 mm，pH 為6 時，抑制效果最弱，抑制圈直徑為9 mm。以不同pH 的蒸餾水作為空白組，發現不同pH 的蒸餾水對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌的增殖沒有任何抑制作用。可見，ABFII的抑菌活性受pH 的影響，在pH 為4 時，對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌的抑制作用最強。而在中性和堿性環境下，ABFII 對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌沒有抗真菌活性。

表2 不同pH 下ABFII 的穩定性研究Tab.2 Stability of ABFII at different pH values

2.2.2 ABFII 在pH 6.12 時熱穩定性

從表3 可以看出，當溫度小于65 ℃時，加熱發酵液15 或30 min，對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌的抑菌圈直徑范圍分別為10～15 mm 和9～13 mm，說明ABFII 在溫度低于65 ℃時對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌的抗真菌活性沒有影響。而當溫度高于75 ℃以后，加熱發酵液15 或30 min，它就失去了抗真菌能力。

表3 ABFII 對熱的敏感性Tab.3 Sensitivity of ABFII to heat

熱穩定性試驗和pH 敏感性試驗表明：pH 和溫度對水產副產物發酵液的穩定性有重要影響。GOUTEFONGEA,et al[23]證明pH 高于5.8 時對溶液中蛋白質在熱變性具有保護作用，本實驗在pH 為6.12的條件下進行。CHARPENTIER,et al[24]還表明，在pH 低于5.8 且溫度高于40 ℃時，蛋白質在溶液中的變性非常明顯。ABFII 抗菌化合物的顯著熱變性僅在75 ℃以上時可以觀察到，pH 高于5.8 是一個決定因素，其次短暫的加熱時間也可能是一個決定因素。

pH 影響微生物增殖可以作用于以下幾個因素：蛋白質殘基(或肽殘基)的電離，蛋白質的三級結構和穩定性，作為短鏈蛋白質，抗菌肽具有pH 敏感特性等[25]。據報道，大多數已知的抗菌肽是陽離子的，它們的作用機制與它們的陽離子特性和在溶液中與目標磷脂膜接觸時適應兩親性結構的能力有關[26]。增加肽的正電荷從而提高其抗菌和溶血活性[27-28]，相反，肽正電荷的減少導致抗菌活性的喪失。MATSUZAKI,et al[28-29]也證實正電荷的減少會導致靜電相互作用力的減少，然后被疏水相互作用所取代。事實上，這和我們的發酵液ABFII 在酸性條件下對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌具有抗菌活性，在堿性條件下，ABFII 的抗菌活性喪失的結論一致。從ABFII 的抗菌混合物對溫度和pH 敏感實驗中可以預測其活性物質是肽，對此需要更加深入的研究。

2.3 發酵液的化學組成

表4 顯示發酵液樣品A、ABFI 和ABFII 的化學成分。結果表明，ABFII 和樣品A 的化學成分相近。ABFI 中部分化學成分含量比ABFII 和樣品A 要少的多。

表4 不同發酵液的化學成分Tab.4 Chemical composition of the different fermented liquid

從發酵液化學組成實驗結果可以看出利用發酵菌株發酵的水產加工副產物的蛋白質，游離氨基酸，脂肪和氮磷鉀含量已和市售有機液肥含量接近，礦物元素鎂鐵的含量甚至超過市售肥料，鈣硫硼錳銅鉬的含量接近市售肥料。不僅提高了水產加工副產物的利用率，減少環境污染，甚至還可以替代市售肥料，提高經濟效益。EM 菌發酵的水產加工副產物的脂肪，碳水化合物和氮磷鉀含量和樣品A 的含量接近，其余成分的含量相差較大。樣品A 和ABFII 的化學成分接近，活性相差巨大，可能是由于ABFII 所用篩選的菌株能夠產具有活性的功能物質，和發酵液穩定性試驗結果預測相同。

2.4 盆栽試驗結果

圖3 是分別用自來水空白組和ABFII 實驗組培養的甘藍型油菜。從圖3 可以看出，ABFII 培養的油菜葉片比空白組培養的明顯肥大。從圖4 可以看出，與空白組相比，以ABFII 作為肥料的油菜最大葉片的長度比空白組長1 cm，直徑大2 cm；最小葉片的長度和直徑都比空白組葉片大0.5 cm，說明ABFII 能夠促進植物生長，具有一定的肥力。這和KIM[6]證明魚的廢棄物用作液體肥料有非常大的潛力的結果一致。從圖5 可以看出，和用自來水處理的甘藍型油菜相比，用多菌靈處理的油菜葉片中殘留的擬盤多毛孢數量很少，抑制率達到99%，用ABFII 處理后，抑制率達到95%。

圖3 ABFII 對植物生長的促進作用Fig.3 In vitro plant growth promotion effects of ABFII

圖4 ABFII 處理1 周后，A.蔬菜最大葉片的長度和直徑；B.蔬菜最小葉片的長度和直徑Fig.4 After one week treatment with ABFII,A.The lengths and diameters of vegetable the biggest leaves;B.The lengths and diameters of vegetable the smallest leaves

圖5 殘留真菌的微生物檢驗Fig.5 Microbiological test of the fungi remaining

盆栽實驗表明經過ABFII 處理的蔬菜葉片較空白組有明顯的促生長作用，在葉片長度和直徑方面都有明顯效果。ABFII 不僅提供了大量有利于土壤中微生物分解的小分子物質，還保留原料中植物生長所必需元素，包括必需大量氮磷鉀元素和鎂鈣硼錳等必需微量元素，促進植物的生長[30]。同時各組葉片的真菌培養表現出ABFII 中生物活性物質可以有效抑制油菜上擬盤多毛孢的增值，接近商業殺蟲劑的抑制率。這為開發天然農藥提供理論基礎，為園藝發展帶來巨大的進步。

3 結論

在3 種水產副產物的發酵液中，只有ABFII 對擬盤多毛孢和瓜鏈格孢菌顯示出抗菌活性。蔬菜盆栽試驗也表明，ABFII 不僅具有一定的肥力，促進植物的生長，還可被用于開發成為一種天然生物農藥，在園藝中作為化學農藥的替代品。