雌性激素調控ERβ-ERK1/2途徑影響人牙周膜成纖維細胞骨改建

趙璽 李向宇 丁銳 趙浩然 米叢波 吳曉琴

hPDLF細胞是牙周膜的重要功能細胞，其主要功能為：調節牙周組織穩態，形成膠原結構蛋白，發揮天然免疫防御的調節功能[1-3]。在口腔正畸治療中，hPDLF細胞可發揮重要的中介作用，并且是正畸治療中壓槽改建的直接效應細胞[4]。有研究表明，雌激素可調控在骨重建過程中具有重要調控作用的細胞因子的表達，并且牙周膜成纖維細胞存在雌激素受體β(ERβ)基因的表達[5,6]。亦有研究表明，ERβ能夠參與hPDLF細胞成骨分化等過程[7]，那么雌激素是否能夠通過誘導ERβ的表達而影響下游相關的信號通路的激活筆者尚未見相關研究，所以，本文探究了雌激素對hPDLF細胞骨改建的影響，并且探究其機制，旨在為臨床的研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 健康正畸患者拔除的前磨牙6顆(經患者知情并同意)；DMEM高糖培養基(美國Gibco公司)；17β-雌二醇(美國Sigma公司)；cDNA合成試劑盒、qPCR檢測試劑盒(福麥斯生物技術有限公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；Vimentin、CK18、ER-β、ERK1/2、GAPDH一抗、山羊抗兔二抗、熒光二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)；CCK8試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司)；siRNA轉染試劑盒(福麥斯生物技術有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司)。

1.2 細胞分離與培養 將所獲得正畸患者的牙齒迅速轉移至超凈工作臺中，用手術刀刮取根中1/3的牙周膜，加入0.1%的Ⅰ型膠原酶與牙周膜組織混和均勻，于37℃的水浴鍋中震蕩消化40 min，然后使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基稀釋，并接種于細胞培養皿中，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，隔天換液，培養至細胞匯合率達80%時，使用0.25%的胰蛋白酶消化，并傳代。

1.3 免疫熒光 本文使用免疫熒光鑒定hPDLF細胞的標志蛋白波形絲蛋白(Vimentin)和細胞角蛋白(CK18)，主要步驟為：將hPDLF細胞接種于24孔板中，培養至細胞完全貼壁，去除培養基后用PBS清洗3次，然后加入4%的多聚甲醛溶液固定15 min，PBS清洗3次后，使用0.5% TritonX-100室溫通透20 min，PBS清洗3次后，加入5%的胎牛血清封閉30 min，清洗后每孔加入適量的Vimentin、CK18一抗稀釋液，4℃固定過夜，TBST清洗3次后，每孔加入稀釋后的熒光二抗，避光染色1 h，清洗后滴加DAPI染料染色5 min，TBST洗去多余的DAPI染料，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 siRNA轉染 根據脂質體2000轉染試劑說明書轉染ERβ siRNA以及 negative control，主要步驟為：將對數生長期的ARPE-19細胞接種至6孔板中，細胞生長至70%時，按說明書將siRNA質粒與脂質體2000轉染試劑混合，室溫共孵育20 min后加入細胞培養基中，共孵育48 h后進行后續實驗。

1.5 CCK8法檢測細胞增殖 取hPDLF細胞，用不含抗生素的DMEM完全培養基稀釋至3×104個/ml，96孔板每孔加入100 μl上述配好的細胞稀釋液，每組設置5個復孔，并且設置24 h、48 h、72 h 3個時間梯度，按相同的方法平行接種3塊相同的96孔板；然后將3塊96孔板放置在培養箱中培養，分別于24 h、48 h、72 h后取出對應的96孔板，避光向每孔中加入10 μl的CCK-8試劑，繼續在培養箱中培養2 h，然后使用酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度。以空白組吸光度為背景值，OD值越大表示細胞增殖能力越強。

1.6 qRT-PCR 取對數生長期的hPDLF細胞1×106于RNA-free的離心管中，每管加入1 ml的Trizol溶液裂解5 min，每孔加入200 μl氯仿，靜置分層后，12 000×g，4℃離心15 min，離心后取上層液體，并加入500 μl 異丙醇，12 000×g，4℃離心10 min，去除上清，收集RNA沉淀，用1 ml 75%乙醇溶液重懸RNA沉淀，12 000×g，4℃離心10 min，所得沉淀用20 μl RNA-free水重懸，55℃水浴10 min，即為總RNA，使用核酸定量儀檢測總RNA含量。根據cDNA Synthesis 試劑盒指示配置反應體系，將提取的hPDLF細胞RNA逆轉為cDNA，然后利用核酸定量儀對cDNA進行定量。然后根據qPCR試劑盒指示配置反應體系，進行qPCR反應，采用GAPDH作為內參，反應后采用2-ΔΔCt法計算基因表達水平。見表1。

表1 OPG、RANKL、GAPDH引物序列

1.7 Western blot 取各組hPDLF細胞1×106個于離心管中，每管加入200 μl的RIPA裂解液和2 μl的PMSF，于4℃條件下裂解30 min,12 000×r，4℃離心15 min，取上清，即為細胞總蛋白，根據BCA蛋白定量試劑盒對細胞總蛋白進行定量，定量后每管蛋白加入四分之一體積的Loading buffer，并且沸水浴5 min，使蛋白變性，然后配膠，上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，經過轉膜，封閉后，PVDF膜與相應的抗體4℃孵育過夜，TBST清洗后，二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST、洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發光液，并將PVDF膜浸入發光液中反應30 s，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

2 結果

2.1 hPDLF細胞鑒定結果 對提取的hPDLF細胞進行鑒定，顯微鏡下觀hPDLF細胞形態發現細胞呈長梭形，細胞分布呈漩渦狀，免疫熒光觀察hPDLF細胞表達標志蛋白Vimentin和CK18，說明本文所提取的細胞符合hPDLF細胞的形態結構，表達標志蛋白，符合hPDLF細胞特征，可用于后續研究。見圖1。

圖1 免疫熒光鑒定hPDLF細胞標志蛋白Vimentin和CK18(×20)

2.2 雌激素促進hPDLF細胞增殖 為了探究雌激素對hPDLF細胞增殖能力的影響，本文將hPDLF細胞接種于96孔板后，設置17β-雌二醇0 nmol/L、0.001 nmol/L、0.01 nmol/L、0.1 nmol/L組每組5個復孔，CCK8法檢測17β-雌二醇對hPDLF細胞增殖能力的影響，24、48、72 h時，0.001 nmol/L、0.01 nmol/L、0.1 nmol/L 17β-雌二醇組細胞增殖能力均顯著高于0 nmol/L組(24 h:t=5.13、6.56、6.68，48 h：t=6.46、6.29、9.56，72 h：t=5.32、13.13、16.90，P<0.05)，并且隨著給藥濃度的增加，細胞增殖能力越高，說明雌激素促進hPDLF細胞增殖。見表2。

表2 CCK8檢測雌激素對hPDLF細胞增殖能力的影響

2.3 雌激素影響hPDLF細胞OPG和RANKL表達 將0 nmol/L、0.001 nmol/L、0.01 nmol/L、0.1 nmol/L 17β-雌二醇與hPDLF細胞共孵育后，qPCR檢測hPDLF細胞中OPG和RANKL表達，相比于0 nmol/L 17β-雌二醇組細胞，0.001、0.01、0.1 nmol/L 17β-雌二醇組細胞OPG表達顯著上調(t=5.02、18.81、21.77，P<0.05)，RANKL表達顯著下調(t=5.02、18.81、21.77，P<0.05)，提示雌激素能夠影響OPG和RANKL表達，調控hPDLF細胞骨改建。見表3。

表3 qPCR檢測雌激素對hPDLF細胞OPG和RANKL表達的影響

2.4 雌激素促進hPDLF細胞ERβ表達和ERK1/2磷酸化 Western blot檢測雌激素對hPDLF細胞ERβ-ERK1/2途徑的影響，0.001、0.01、0.1 nmol/L 17β-雌二醇組雌激素受體ERβ表達水平顯著高于0 nmol/L 17β-雌二醇組(t=12.63、131.00、14.57，P<0.05)，ERK1/2磷酸化水平顯著高于0 nmol/L 17β-雌二醇組(t=31.09、20.55、24.98，P<0.05)，說明雌激素能夠上調ERβ表達，激活ERK1/2信號通路。見表4，圖2。

表4 Western blot檢測雌激素對ERβ表達和ERK1/2磷酸化的影響

圖2 Western blot檢測17β-雌二醇對ERK1/2信號通路的影響

2.5 雌激素通過上調ERβ的表達而促進hPDLF細胞增殖 為了驗證雌激素是否通過上調ERβ的表達而影響細胞增殖，本文設計并合成了ERβ的siRNA，并轉染至hPDLF細胞抑制ERβ表達，將轉染后的hPDLF細胞與0.1 nmol/L的17β-雌二醇孵育，并設置相應的對照組，CCK8檢測結果顯示，與0 nmol/L 17β-雌二醇+si-NC組、0.01 nmol/L 17β-雌二醇+si-NC組比較，hPDLF細胞在24、48、72 h增殖能力均顯著增加(t=6.60、8.50、9.67,P<0.05)，與0.01 nmol/L 17β-雌二醇+si-NC組、0.01nmol/L 17β-雌二醇+si-ERβ組比較，hPDLF細胞在24、48、72 h增殖能力均顯著降低(t=5.51、10.45、7.76,P<0.05)，說明雌激素可通過上調ERβ的表達而促進hPDLF細胞增殖。見表5，圖3。

表5 CCK8檢測雌激素及對ERβ細胞增殖的影響

圖3 CCK8檢測雌激素及ERβ對細胞增殖的影響；與0 nmol/L 17β-雌二醇+siNC組比較，*P<0.01；與0.1 nmol/L 17β-雌二醇+siNC組比較，#P<0.01

2.6 雌激素通過上調ERβ的表達而促進OPG和RANKL表達 qPCR檢測結果顯示，0.1 nmol/L 17β-雌二醇+siNC組細胞OPG表達顯著高于0 nmol/L 17β-雌二醇+siNC組(t=11.43,P<0.01)，RANKL表達顯著低于0 nmol/L 17β-雌二醇+siNC組(t=28.77,P<0.01)，而0.1 nmol/L 17β-雌二醇+siERβ組細胞OPG表達顯著低于0.1 nmol/L 17β-雌二醇+siNC組(t=9.12,P<0.01)，RANKL表達顯著高于0.1 nmol/L 17β-雌二醇+siNC組(t=13.42,P<0.01)，說明雌激素可通過上調ERβ的表達而調控OPG和RANKL表達。見表6。

表6 qRCR檢測雌激素及ERβ對OPG和RANKL表達的影響

2.7 雌激素通過上調ERβ的表達而促進ERK1/2信號通路的激活 接下來本文探究了雌激素是否能夠通過上調ERKβ的表達而影響ERK1/2信號通路的激活，Western blot檢測結果顯示，0.1 nmol/L 17β-雌二醇+siNC組細胞ERβ的表達和ERK1/2的磷酸化水平顯著高于0 nmol/L 17β-雌二醇+siNC組(t=18.68、11.89,P<0.01)，而0.1 nmol/L 17β-雌二醇+siERβ組細胞ERβ的表達和ERK1/2的磷酸化水平顯著低于0.1nmol/L 17β-雌二醇+siNC組(t=11.00、13.17，P<0.01)，說明雌激素可通過上調ERβ-ERK1/2途徑而促進hPDLF細胞骨重建。見表7，圖4。

表7 Western blot檢測雌激素及ERβ對ERK1/2信號通路的影響

圖4 Western blot檢測雌激素及ERβ對ERK1/2信號通路的影響；A 0 nmol/L 17β-雌二醇+si-NC組；B 0.01 nmol/L 17β-雌二醇+si-NC組；C 0.01nmol/L 17β-雌二醇+si-ERβ組

3 討論

hPDLF細胞是一種異質性細胞，在正畸治療中，參與牙周組織的重建和修復，因此，提高hPDLF細胞的重建能力有助于正畸的臨床治療效果[8]。有研究表明，雌激素可在牙周疾病中發揮促進牙槽骨吸收作用，并且雌激素和孕激素可以促進hPDLF細胞的成骨分化[9]，本文主要探究了雌激素對hPDLF細胞骨重建的影響，并且探究了其機制。

hPDLF細胞的增殖能力與其成骨分化和骨重建密切相關，本文將hPDLF細胞與0.001 nmol/L、0.01 nmol/L、0.1 nmol/L17β-雌二醇共孵育后發現hPDLF細胞的增殖能力均顯著增加，說明雌激素具有促進hPDLF細胞增殖的作用。RANKL在對破骨細胞分化調節中起到重要的調節作用，可與其受體RANK結合，進而促進破骨細胞前體細胞分化，從而誘導破骨細胞形成，并且增強破骨細胞的骨吸收[10,11]。OPG亦是在骨分化和重建中發揮作用的重要調控因子，與RANKL競爭性結合RANK，抑制破骨細胞前體細胞的分化，同時抑制成熟破骨細胞的活化，RANKL和OPG共同作用保證機體成骨系統的動態平衡[12,13]；本研究發現雌激素作用后RANKL表達顯著下調，OPG表達顯著上調，說明雌激素能夠通過下調RANKL，上調OPG而抑制破骨細胞分化，抑制骨吸收，刺激骨形成。

有研究表明，ERK1/2信號通路的激活能夠促進調控多種口腔疾病[14]，并且ERβ-ERK1/2信號通路，已有研究在腫瘤的侵襲和轉移中發揮作用[15]。實驗研究發現，經過雌激素誘導后hPDLF細胞雌激素受體ERβ表達顯著增加，ERK1/2磷酸化水平亦顯著增加，說明雌激素能夠促進雌激素受體的表達，及ERK1/2信號通路的激活，即調控ERβ-ERK1/2途徑。

為了探究雌激素是否通過調控ERβ-ERK1/2途徑而調控骨重建，本文設計合成了ERβ的siRNA，并轉染至hPDLF細胞，并且發現轉染后，雌激素促hPDLF細胞骨改建的功能被顯著抑制，并且ERK1/2信號通路的激活亦被顯著抑制，提示雌激素能夠通過調控ERβ-ERK1/2途徑而調控骨重建。

綜上所述，雌激素能夠促進hPDLF細胞的骨改建，其機制為激活ERβ-ERK1/2信號通路，但是其精細的調控機制即臨床的應用還需進一步研究。