IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223在子宮肌瘤組織中的表達及相關性研究

姜艷婷 陳琳 李卓 高丹丹 張寧

子宮肌瘤屬于一種在女性盆腔中較為常見的實體腫瘤，由子宮平滑肌細胞增生所致，在女性生育期間發(fā)生率較高，多發(fā)于>30歲的女性，子宮肌瘤發(fā)生后患者多存在較為明顯的盆腔受壓、月經(jīng)紊亂增多、貧血、子宮異常出血、腰骶部疼痛、不孕、流產(chǎn)等癥狀，在一定程度上影響著患者的日常生活和生命安全[1,2]。目前臨床上對于子宮肌瘤的發(fā)生機制尚不完全明確，但部分研究認為，此病的發(fā)生與多種細胞因子表達異常相關[3]。基于此，在本文研究中探究人含IQ基元GTP酶激活蛋白2(IQGAP2)、微小染色體維持蛋白7(MCM7)、硫酸基轉移酶2A1(SULT2A1)、微小RNA-223(miRNA-223)在子宮肌瘤組織中的表達及相關性，為臨床上子宮肌瘤的診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2020年1月我院收治的子宮肌瘤患者85例作為研究對象，年齡28～56歲，平均年齡(39.90±13.3)歲；月經(jīng)正常34例，月經(jīng)異常51例；腫瘤直徑>5 cm 22例，腫瘤直徑≤5 cm 63例；肌瘤數(shù)量：多發(fā)29例，單發(fā)56例；肌瘤部位：肌壁間26例，漿膜下30例，黏膜下29例；病理類型：平滑肌瘤37例，腺肌瘤48例。本次研究患者及家屬均知情，簽署了知情同意書，且經(jīng)我院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：所有患者經(jīng)影像學和病理組織學確診為子宮肌瘤。

1.2.2 排除標準：合并嚴重器官疾病者；近3個月內有類固醇激素用藥史；合并肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤者；合并內分泌疾病者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集:取所有患者手術切除的子宮肌瘤組織、瘤旁組織標本，其中50%組織樣本采用40 g/L的多聚甲醛進行固定，并進行常規(guī)石蠟包埋，厚度為3 μm，連續(xù)切片作免疫組化標記；另外50%組織樣本放置于液氮中冷凍，在溫度為-80℃的冰箱中保存。

1.3.2 免疫組化:采用免疫組化檢測IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223在子宮肌瘤組織、瘤旁組織中表達，將石蠟切片標本放在二甲苯中脫蠟處理10 min，將二甲苯更換后再放置10 min，然后梯度乙醇水化；加入蛋白酶修復液，在37℃的恒溫冰箱中孵化30 min，棄抗原修復液；切片移入濕盒中加入3%的H2O2后，采用去過氧化物酶封閉液進行密封，恒溫冰箱孵育10 min，采用PBS沖洗；加入適量的山羊血清，在室溫環(huán)境下封閉30 min；用濾紙將封閉液吸取，加入一抗，放入濕盒，然后再加入二抗，室溫孵育1 h，采用PBS沖洗；經(jīng)過DAB顯色處理10 min，在顯微鏡下觀察陽性反應，之后脫水并封片處理。每份標本在鏡頭下隨機選擇5個視野，所有病理切片由2位以上經(jīng)驗豐富的醫(yī)師采用雙盲法進行確診。根據(jù)染色程度和染色細胞百分比進行評分：不著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；著色細胞數(shù)≤5%0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，≥51% 3分。陰性(-)得分≤1分，弱陽性(+)得分2～3分；中度陽性(++)得分4～5分；強陽性(+++)得分≥6分。

1.3.3 Western Blot法:采用Western Blot法檢測IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223在子宮肌瘤組織、瘤旁組織中的表達量，取液氮中冷凍的子宮肌瘤組織、瘤旁組織，10 000×g離心處理10 min，提取上清液，BCA進行蛋白定量檢測，在2×SDS凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環(huán)境中加熱5 min有助于蛋白發(fā)生變性。凝膠電泳完、轉膜，取膜，4℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時間為1 h，將一抗使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋(IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223一抗為1∶1 000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，5 min/次，二抗被0.05%～0.1% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，處理時間為5 min。DAB顯色，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH為內參。

2 結果

2.1 IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223在子宮肌瘤組織和瘤旁組織中的表達比較 與瘤旁組織比較，子宮肌瘤組織中IQGAP2、SULT2A1表達量顯著降低，MCM7、miRNA-223表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1，圖1～4。

表1 IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223在子宮肌瘤組織和瘤旁組織中的表達比較

子宮肌瘤組織 瘤旁組織

子宮肌瘤組織 瘤旁組織

2.2 IQGAP2、MCM7表達與子宮肌瘤患者臨床特征的相關性分析 IQGAP2、MCM7表達與子宮肌瘤患者年齡、肌瘤數(shù)量、肌瘤部位無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；IQGAP2、MCM7表達與子宮肌瘤患者月經(jīng)情況、肌瘤直徑、病理類型相關，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

子宮肌瘤組織 瘤旁組織

子宮肌瘤組織 瘤旁組織

表2 IQGAP2、MCM7表達與子宮肌瘤患者臨床特征的相關性分析

2.3 SULT2A1、miRNA-223表達與子宮肌瘤患者臨床特征的相關性分析 SULT2A1、miRNA-223表達與子宮肌瘤患者年齡、肌瘤數(shù)量、肌瘤部位無關(P>0.05)；SULT2A1、miRNA-223表達與子宮肌瘤患者月經(jīng)情況、肌瘤直徑、病理類型相關，與月經(jīng)正常、肌瘤直徑≤5 cm、腺肌瘤患者比較，月經(jīng)異常、肌瘤直徑>5 cm、平滑肌瘤患者SULT2A1表達量顯著降低，miRNA-223表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 SULT2A1、miRNA-223表達與子宮肌瘤患者臨床特征的相關性分析

2.4 IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223之間相關性分析 IQGAP2與MCM7呈負相關(r=-0.273,P=0.012)；IQGAP2與SULT2A1呈正相關(r=0.261,P=0.016)；IQGAP2與miRNA-223呈負相關(r=0.290,P=0.007)；MCM7與SULT2A1呈負相關(r=-0.344,P=0.001)；MCM7與miRNA-223呈正相關(r=0.342,P=0.001)；SULT2A1與miRNA-223呈負相關(r=-0.249,P=0.022)。見圖5。

圖5 IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223之間相關性分析

3 討論

子宮肌瘤的發(fā)生屬于多種因素共同作用的結果，目前對于此病的發(fā)生機制尚不完全明確，因此在此背景下，本文分析IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223與子宮肌瘤的相關性，為臨床上此病的診治提供參考。

含有IQ結構的GTP酶活化蛋白屬于一類多位點支架蛋白，其包括IQ結構區(qū)、多聚脯氨酸結合區(qū)、鈣調蛋白同源性結合區(qū)、Ras GTP酶活化蛋白相關結合區(qū)，上述區(qū)域通過與相應的蛋白結合，調節(jié)細胞凋亡、黏附、骨架、細胞因子等細胞轉導通路，參與瘤的形成[4,5]。IQGAP2屬于一種GTP酶活性蛋白，其分子量大約為180 KD，內含1 575個氨基酸，在人染色體5q13上所定位，屬于IQGAP家族成員之一[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，IQGAP2在及活化血小板絲狀偽足、胃腺細胞微觀的膜處表達，其基因突變可促進多種惡性腫瘤的進展，包括胃癌、食管癌、肝癌等[7]。另外有研究顯示，IQGAP2屬于一種雌激素依賴抑癌基因，而臨床上多認為子宮肌瘤是體內雌激素水平過高，長期受雌激素刺激所引發(fā)的疾病，因此有理由認為IQGAP2可能與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展相關[8]。本文研究結果顯示，IQGAP2在子宮肌瘤組織中呈現(xiàn)為低表達，且與患者月經(jīng)情況、肌瘤直徑、病理類型相關，但目前臨床上并未有研究認為IQGAP2與子宮肌瘤相關，因此本文研究結果還需研究進一步深入研究證實，為臨床上子宮肌瘤的診治提供新方向。

瘤的形成與細胞周期密切相關，而細胞周期與DNA復制相關，MCM屬于一組與DNA復制和細胞增殖相關的蛋白家族，在DNA復制、基因組、染色體重構等過程中具有重要的調控作用[9]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在細胞中MCM蛋白表現(xiàn)為周期性表達規(guī)律，在細胞處于G1/S轉換時其表達量最高，在細胞處于G0期時其表達量最低，甚至不表達，因此臨床上多采用MCM蛋白評價細胞增生狀態(tài)[10]。MCM7屬于MCM家族成員之一，在DNA復制起始過程的穩(wěn)定維持中具有重要的作用，可保證一個周期中DNA復制僅有一次，其水平顯著升高表示細胞增殖、增生顯著[11]。目前已有研究顯示，MCM7在多種惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)為異常高表達，包括膀胱癌、非小細胞肺癌等，其水平升高在一定程度上促進了瘤細胞增殖，當其表達受到抑制后可抑制癌細胞增殖，抑制疾病進展[12]。張冬紅等[13]在其研究中顯示，MCM7在子宮肌瘤組織中呈現(xiàn)為高表達。基于前期研究，本文進一步驗證MCM7在子宮肌瘤組織中的表達，結果顯示，MCM7在子宮肌瘤組織中呈現(xiàn)為高表達，且與患者月經(jīng)情況、肌瘤直徑、病理類型相關，臨床上可根據(jù)其表達高低判斷患者疾病程度。

目前隨著臨床上對于子宮肌瘤的深入研究發(fā)現(xiàn)，雌激素硫酸轉移酶與子宮肌瘤的發(fā)生相關，SULTs超家族主要包括SULT1、SULT2兩個亞族，其家族成員的主要作用為催化羥基類固醇硫酸化，包括孕烯醇酮、脫氫表酮、催化雄酮等[14]。SULT2A1屬于SULT2家族成員之一，屬于一種磷酸基團轉移酶，主要參與某些外源性復合物的硫酸化轉化和雌激素的無活性代謝過程，經(jīng)修飾睪酮、雌激素受體，作用于雌激素，激活其下游通路，發(fā)生一系列的級聯(lián)反應[15]。另外有研究顯示，SULT2A1其含有多重絲氨酸結構，可經(jīng)磷酸修飾平滑肌細胞膜上的糖蛋白，改變雌激素敏感性，就其對雌激素的調控作用而言，SULT2A1可能參與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。本文研究結果顯示，SULT2A1在子宮肌瘤組織中呈現(xiàn)為低表達，且與患者月經(jīng)情況、肌瘤直徑、病理類型相關，臨床上可根據(jù)其表達高低判斷患者疾病程度。

miRNA屬于一類內源性小RNA，其長度為18～24個核苷酸，在機體處于正常生理狀態(tài)下時，miRNA具有嚴格的組織時序特異性，但在機體處于腫瘤環(huán)境下，miRNA出現(xiàn)異常表達，與抑癌基因的作用相關[17]。臨床研究表明，miRNA與細胞增殖、分化、代謝、凋亡過程相關，與瘤的發(fā)生發(fā)展相關[18]。miRNA-223屬于miRNA家族成員之一，有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-233與卵巢癌、子宮內膜癌等女性特發(fā)性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關[19]。目前筆者并未發(fā)現(xiàn)臨床上有研究認為miRNA-233與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展相關，本文研究結果顯示，miRNA-223在子宮肌瘤組織中呈現(xiàn)為高表達，且與患者月經(jīng)情況、肌瘤直徑、病理類型相關，此結果提示著，miRNA-223可能與子宮肌瘤患者疾病進展相關，可作為特異性診斷子宮肌瘤的指標。

綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)，IQGAP2、SULT2A1、MCM7、miRNA-223在子宮肌瘤組織中異常表達，與患者月經(jīng)情況、肌瘤直徑、病理類型相關，且四者之間具有一定的相關性，可能共同參與此病的發(fā)展，可用于臨床上子宮肌瘤的診斷。