上海市造血干細胞捐獻志愿者口腔拭子樣本的分型成功率及其影響因素

朱臻逸 ，杜克明 ，廖寬鎮 ，劉寶松 ，張 鋼 ，呂 軍

1復旦大學公共衛生學院，上海，200032；2復旦大學中國殘疾問題研究中心，上海，200032；3上海荻碩貝肯醫學檢驗所有限公司，上海，201318；4上海市紅十字會，上海，200040

我國造血干細胞志愿捐獻者的采樣一直以靜脈血采樣為主。雖然靜脈血采樣技術較為成熟，但存在著采樣時間和空間受限的缺點，目前已經在一定程度上影響了造血干細胞志愿捐獻者的采集積極性和主動性[1-2]。而作為另一種受時間和空間限制較小的采樣方式，通過人體口腔拭子采集口腔黏膜脫落細胞，已經被國內外經驗證明是一種更為便捷和安全的DNA獲取方式，在技術層面也已經較為成熟[3-5]。但是，由于口腔拭子技術對于樣本采集規范和保存條件等要求較高[6]，在2015年進行的上海市口腔拭子采樣前期試點工作中，獲得樣本的分型成功率較低，效果不理想。目前國內外研究主要聚焦于口腔拭子的基因含量、基因質量與應答率、分離方法和實驗條件[3-6]，結合其在造血干細胞捐獻志愿者采樣入庫等社會實踐工作的實際效果研究較少。經過本研究團隊、上海市紅十字會和實驗室團隊的合作努力下，應用口腔拭子進行造血干細胞志愿者入庫采樣的全流程規范與相關技術在上海市日漸成熟。為進一步了解該技術采集所得樣本的分型成功率，本研究分析了2015-2018年上海市口腔拭子采樣的分型成功率現狀及其影響因素，旨在對口腔拭子采集法的有效性和可行性提供一定的數據和經驗支持。

1 資料來源與方法

1.1 數據來源

本研究的研究資料分別來源于上海市承擔造血干細胞樣本檢測的實驗室和中華骨髓庫上海分庫，于2018年3-5月，共采集2015-2018年4年間的造血干細胞志愿者信息8104條。其中，實驗室方面提供志愿者口腔拭子樣本的檢測結果信息，中華骨髓庫上海分庫方面則提供志愿者的造血干細胞資料庫信息。

1.2 研究方法

上海市口腔拭子樣本的檢測實驗，從試點成立開始一直由同一家檢測實驗室完成。通過前期關鍵知情人訪談及現場調查了解到，樣本分型成功即可進行造血干細胞志愿者登記入庫，是樣本采集入庫這一步工作的唯一指標，因此選取其作為本研究關注的核心指標。

本研究取得的志愿者口腔拭子樣本檢測結果信息條目包括志愿者的采樣編號、實驗室樣本接收時間、樣本首次檢測時間、每個位點擴增次數和樣本是否成功分型。取得的志愿者造血干細胞資料庫信息包括志愿者的采樣編號、性別、年齡、職業、學歷、獻血經歷。

1.3 統計學方法

應用 Excel 2016建立數據庫，采用VLOOKUP函數對志愿者資料庫中的信息和樣本檢測結果進行精確匹配。應用SPSS 22.0進行統計學分析，主要采用描述性分析、卡方檢驗和logistic回歸分析等統計學分析方法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 調查對象基本情況

共收集志愿者樣本信息8104條，男性4486人(55.36%)，女性3618人(44.64%)。≤25歲和26-35歲的人較多，占比分別為44.39%和33.58%，36-45歲和46歲及以上的人占比分別為19.32%和2.31%。學歷方面，初中及以下876人，占10.81%；高中及大專2473人，占30.52%；本科4258人，占52.54%；研究生497人，占6.13%。民族以漢族為主，占97.64%，非漢族占2.36%。戶籍方面，上海和非上海人數接近，占比分別為47.58%和52.42%。

2.2 口腔拭子樣本的分型成功率情況分析

對不同年份間的口腔拭子樣本分型成功率進行比較分析，發現其分型成功率逐年遞增，從2015年的96.97%上升至2018年的99.78%，經趨勢卡方檢驗，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同年份口腔拭子樣本分型率之間的差異 n(%)

目前造血干細胞志愿者入庫采樣的方式以靜脈血采樣為主，已經廣泛使用了多年并被認為較為有效，可作為分型成功率的參考標準。因此，為了驗證口腔拭子樣本的分型成功率是否已達到較為可靠的水平，將2018年口腔拭子樣本與2018年的傳統靜脈血樣本的分型成功率進行比較，二者差異不具有統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同采樣方式分型成功率的比較分析

2.3 影響口腔拭子樣本分型結果的單因素分析

對無序變量采用交叉表χ2檢驗，有序變量采用非參數檢驗，連續性變量采用t檢驗。結果顯示，戶籍、獻血經歷差異和樣本采集檢測時間間隔有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 影響分型結果的單因素分析 n(%)

2.4 影響口腔拭子樣本分型結果的多因素分析

選擇單因素logistic回歸有統計學意義的變量 (性別、年齡、文化程度)，并納入時間因素進行調整，采用條件參數似然估計的向前法進行logistic回歸分析，回歸模型的調整R2為0.17，模型結果可用。結果顯示，戶籍、獻血經歷和樣本采集檢測時間間隔是影響口腔拭子樣本分型結果的因素(P<0.05)；另外，相較于2015年，2018、2017和2016三個年份的口腔拭子樣本分型成功率更高。見表4。

表4 影響分型結果的多因素logistic回歸分析

3 討論

3.1 口腔拭子樣本的分型成功率已經較為理想

研究結果顯示，口腔拭子樣本的分型成功率逐年增高，利用2018年的實驗室數據，將口腔拭子采樣方式分型成功率與現有成熟的靜脈血采樣的分型成功率進行比較，僅差0.17%，經卡方檢驗認為兩者之間不存在差異。說明2018年口腔拭子樣本已經可以達到與靜脈血樣本同樣的效果。相關經驗已經證明，從實驗室技術的角度，該檢測方法已經較為成熟[7]，尤其在口腔拭子和外周血的比較中，口腔拭子采集樣本提取DNA的濃度與擴增成功率已經與外周血方式采集的無差異，其測序結果也與人類線粒體DNA劍橋參考序列沒有差異[8]。因此，口腔拭子采集的樣本目前已有較為可靠的成功率，能夠促進造血干細胞入庫工作順利進行。

3.2 戶籍、獻血經歷和采集檢測時間間隔是影響口腔拭子樣本分型結果的主要因素

研究結果顯示，上海戶籍志愿者的樣本分型成功率高于非上海戶籍，可解釋為由于本次實驗是在上海進行，上海戶籍的志愿者與工作人員的交流更順暢，本地居民對于本地政府工作的信任度和配合度比外地居民要高，戶籍人口的民生滿意度相較非戶籍人口也會更高[9]，從而使得上海戶籍志愿者樣本的前期準備和現場采集會更加嚴格地按照科學規范進行，因此擁有更高的分型成功率。而相較于有獻血經歷的志愿者，沒有獻血經歷的志愿者樣本分型成功率反而更高，可能是由于沒有獻血經歷的志愿者普遍對采樣方式的依從性高，同時沒有個人經驗作為支撐，對醫生建議非常重視，操作更加謹慎規范。而有過獻血經歷的志愿者，更熟悉傳統靜脈血采樣流程，也較認可靜脈血采樣這一方式與效率，因此可能對口腔拭子這一方式的依從性較低，導致一些志愿者在采樣過程中的流程規范性下降，成功率較低。

研究結果還顯示，在口腔拭子采集的樣本中，樣本采集與樣本檢測的間隔時間越長，分型的成功率就越低，這是因為樣本在采集之后的保存和運輸過程中，可能會因為溫度、濕度、微生物[10]等因素的影響導致DNA丟失或降解，使得樣本成為無效樣本。因此，采集與檢測之間的時間間隔越長，由于保存不當而使得樣本失效的可能性就越高。

3.3 優化關鍵環節有利于推動口腔拭子技術的有效應用

本研究結果提示，口腔拭子技術的有效應用依賴于以下幾個關鍵環節：①優選口腔拭子采樣人群[11]。根據本文的研究結果，在志愿者造血干細胞入庫時，上海戶籍、沒有獻血經歷的志愿者口腔拭子樣本相較于非上海戶籍、有獻血經歷的志愿者分型成功率更高，因此在志愿者充足有選擇余地的情況下，應盡可能選擇上海戶籍、沒有獻血經歷的志愿者進行口腔拭子采樣。②縮減采檢時間間隔[12]。根據本文的研究結果，口腔拭子樣本從采集到檢測的時間間隔越長，其分型成功率就會越低，因此應盡可能地減少口腔拭子樣本采集和實驗室檢測中間間隔的時間，例如在條件允許的前提下，由實驗室直接進行取樣，當天完成樣本的實驗室檢測工作。③進一步加強現場采集管理工作。根據本文的研究結果，從2015年到2018年口腔拭子樣本的分型成功率呈逐年上升的趨勢。由于4年間實驗室流程與技術未作更新，現場采集管理不斷優化，可認為該結果是因為口腔拭子對于操作的要求較高，前期準備、采集過程和樣本保管均有相應的要求，稍有不慎樣本就會被微生物感染[13]，因此隨著現場采集管理工作逐漸成熟規范，樣本的分型成功率也逐漸上升。

綜上所述，口腔拭子采集得到的造血干細胞志愿者樣本已有較為可靠的分型成功率，可作為造血干細胞志愿者招募入庫的一種極為方便、安全的補充采樣方式。由于其受采樣對象、操作規范化、運輸保存環境等條件影響較大，因此在口腔拭子技術應用過程中，優化關鍵流程十分必要。