食管鱗狀細胞癌組織中miR-206的表達及與預后的關系

韓 娜，張彥彥，張中冕，張 芳，曾騰遠，趙文超

1)鄭州大學第二附屬醫院腫瘤科 鄭州 450014 2)鄭州大學基礎醫學院生理學與神經生物學系 鄭州 450001

食管癌是世界范圍內常見的消化道惡性腫瘤，其發病率和病死率均居世界惡性腫瘤的前列[1]。中國是食管癌高發區，發病人數和死亡人數約占全球的50%[2-3]，而且90%以上是食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。ESCC缺乏早期特異性癥狀，確診時多數患者已經發展成晚期，造成ESCC預后較差，5 a生存率較低[4]。因此，尋找有效的預測指標和治療靶點對于ESCC的防治具有重要意義。miR-206是含有21個核苷酸的微小RNA，定位于人染色體6p12.2，在胃癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌及宮頸癌等腫瘤中的表達降低，對多種腫瘤的發生發展起到了重要作用[5-9]。但是，miR-206在ESCC中的表達及作用并不明確。本研究采用實時熒光定量PCR檢測了miR-206在ESCC及癌旁組織中的表達，分析miR-206表達與ESCC臨床病理特征和預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2013年6月1日至2014年11月1日于鄭州大學第二附屬醫院進行手術治療的ESCC患者136例,收集手術切除后的ESCC組織以及配對的癌旁正常組織標本(距離腫瘤邊緣≥2 cm)，保存于-80 ℃低溫冰箱中。患者術前均未接受過化療、放療以及其他抗腫瘤治療。腫瘤分級、TNM 分期按照國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合會2017年第8版食管癌分期標準：高分化29例，中分化79例，低分化28例；Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期104例；N0+N1期77例，N2+N3期59例。136例中，男102例，女34例，年齡39～76歲，中位年齡(四分位數)60(56,68)歲,其中≤59歲66例，>59歲70例。電話隨訪調查患者預后(終點事件為死亡)，時間截至2019年12月1日，共得到完整數據84例，刪失數據52例。本研究經鄭州大學第二附屬醫院倫理委員會審查后批準，所有患者或家屬均簽署了知情同意書。

1.2 主要試劑Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司，miScript Ⅱ RT 試劑盒、下游通用引物和U6引物購自德國QIAGEN公司，FastStart Essential DNA Green Master購自瑞士羅氏公司，上游引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 ESCC和癌旁組織中miR-206表達水平的檢測總RNA的提取及反轉錄：將組織標本研磨成粉后加入Trizol試劑裂解，加入氯仿沉淀蛋白后離心取上清，加入異丙醇沉淀RNA，體積分數75%的乙醇洗滌，取沉淀離心兩次，無酶水溶解沉淀后測定濃度，按照說明書采用miScript Ⅱ RT試劑盒進行反轉錄獲取cDNA。

miR-206上游引物序列：5’-TGGAATGTAAG GAAGTGTGTGG-3’。PCR反應體系：含10 μL熒光染料(FastStart Essential DNA Green Master)，上、下游引物各4 μL(終濃度均為0.4 μmol/L)，cDNA 0.4 μL，無酶水1.6 μL。反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃10 s，40個循環。以U6為內參，計算2-ΔΔCt作為miR-206的表達水平。

1.4 統計學處理應用SPSS 21.0進行分析。采用配對t檢驗比較ESCC和癌旁組織中miR-206表達水平的差異，χ2檢驗分析miR-206表達與患者臨床病理特征的關系。用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗分析不同miR-206表達患者生存狀況的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 ESCC和配對癌旁組織中miR-206的表達ESCC組織中miR-206表達水平為(0.82±1.10)，低于配對癌旁組織(1.60±1.37)(t=5.972，P<0.001)。

2.2 不同臨床病理特征ESCC患者miR-206表達的比較以中位數0.235 6為界值，將136例ESCC患者分為miR-206低表達組(≤0.235 6)和miR-206高表達組(>0.235 6)，結果(表1)表明，腫瘤直徑<5 cm、浸潤深度T1+T2者miR-206高表達率更高(P<0.05)。

表1 miR-206的表達與ESCC臨床病理特征的關系

2.3 miR-206的表達與ESCC患者生存的關系生存分析結果表明，miR-206低、高表達組的生存狀況差異有統計學意義(χ2=5.425，P=0.020)，miR-206低表達組中位生存期(P75,P25)為21.7(10.8,44.0)個月，低于高表達組的29.9(12.7,51.1)個月(圖1)。

圖1 兩組患者的生存曲線

3 討論

miR-206是一種微小RNA，屬于myomiR家族,在骨骼肌中特異性表達，對骨骼肌的生成具有重要的調控作用[10]。同其他微小RNA類似，miR-206可與靶基因mRNA的3’末端非翻譯區結合，在轉錄水平負性調控基因的表達[11]。腫瘤的相關研究[5-9]表明，miR-206在胃癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌及乳腺癌等多種腫瘤中的表達降低，分別通過增加黏蛋白、Bcl2相關永生基因3、血管內皮細胞生長因子、SOX9、Smad3、M2型丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶以及表皮生長因子受體等多種靶基因促進腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移以及血管形成。但是，miR-206在ESCC中的表達及其臨床意義并不明確。

本研究發現，miR-206在ESCC組織中表達降低，表明miR-206可能作為抑癌基因在ESCC的發生發展中發揮重要作用，同miR-206在其他腫瘤中的作用[5-9]一致。此外，本研究還發現，miR-206的表達與ESCC患者的年齡、性別、腫瘤分級、TNM分期以及淋巴結轉移無關，但是miR-206的高表達與腫瘤大小有關，與在乳腺癌中的研究[12]結果類似。也有研究[13-14]表明，miR-206的表達與肺癌及胃癌的大小無關，而是與TNM分期和淋巴結轉移有關，推測可能與腫瘤組織的差異性、標本的數量以及檢測方法有關。本研究還發現，miR-206的表達與浸潤深度有關，浸潤深度T1+T2者，miR-206表達水平高，與胃癌中的相關研究[15-16]結果類似。相關離體實驗[5]表明，miR-206可抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力。結合上述文獻和本研究結果，我們推測，miR-206在ESCC組織中的表達降低，可能具有促進ESCC細胞侵襲的作用。在肺癌、卵巢癌、宮頸癌及乳腺癌的研究[6-9]中發現，miR-206可抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲轉移。

生存分析發現，miR-206低表達的ESCC患者生存時間較短，與在其他腫瘤如胃癌和結直腸癌中的研究結果[16-17]一致，表明miR-206可能是ESCC患者預后的潛在標志物和治療靶點。但是，Du等[18]對食管癌的研究發現，miR-206低表達患者的生存時間較長，與本研究的結果相反。食管癌有兩種主要的病理類型，即腺癌和ESCC，而Du等的研究并未將這兩種類型的食管癌加以區分，這可能是產生不同結果的原因。

綜上所述，miR-206在ESCC組織中的表達降低，miR-206低表達者預后差，miR-206可作為ESCC預后預測及治療的潛在靶點。