苯并(a)芘誘導惡性轉化的BEAS-2B細胞中miRNA和mRNA表達譜的改變

栗振凱，李中秋，孟麗雅，張佳彤，張 巧

1)鄭州大學公共衛生學院衛生毒理學教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學醫院疾病預防控制科 鄭州 450001

肺癌發病隱匿，易轉移，預后差[1-2]，是最危險的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率居全球之首，每年約有120萬人死于肺癌，5 a生存率仍然很低[3]。苯并(a)芘[benzo(a)pyrene，B(a)P]是一種多環芳香烴類化合物，其代謝活化產物是毒性最大的強致癌物，是一種持久性的有機污染物，普遍存在于汽車尾氣、煤、石油等產生的煙和化工產品中，目前已有大量實驗[4-5]證明B(a)P與肺癌關系密切，但是其致癌機制尚不明確。miRNA是一類長度約為22nt的非編碼RNA，它通過與mRNA結合發揮分子功能，包括促進mRNA的降解或增強其翻譯過程、轉錄后調控編碼基因[6-7]等。研究[8-9]表明，miRNA具有很多生物學功能，并且與腫瘤的發生發展有密切的關系。本研究構建染毒B(a)P的永生化人支氣管上皮細胞(BEAS-2B細胞)模型，通過芯片技術檢測染毒和未染毒細胞的miRNA和mRNA表達譜，篩選出差異表達miRNA和mRNA，從而為進一步研究miRNA與肺癌之間的關系提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器BEAS-2B細胞由本課題組留存。B(a)P購自美國Sigma公司，用DMSO溶解制成2.5 g/L的母液待用。RPMI 1640培養基、DMSO和胰蛋白酶均購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自美國Gemini公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；4×gDNA wiper Mix、RNA模板，5×HiscriptRⅡRT SuperMix Ⅱ，AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(Low ROX Premixed)購自南京諾唯贊生物有限公司。mRNA分離試劑盒購自美國Epicentre公司；SureHyb購自美國Agilent公司；miRCRYTMArray Labeling試劑盒、CIP緩沖劑、CIP酶、免疫熒光雙標和酶標記物購自美國Exiqon公司；RNA Flash Labeling 試劑盒購自美國Arraystar公司；7500 Fast實時熒光定量PCR系統購自美國 Applied Biosystems 公司。

1.2 惡性轉化BEAS-2B細胞模型的構建及鑒定取10 μL的B(a)P母液與5 mL培養基混勻，使B(a)P濃度為5 mg/L[10]。BEAS-2B細胞用含B(a)P培養基培養24 h后，棄去含B(a)P培養基，胰蛋白酶消化、常規傳代；當細胞再次融合至約70%時，再次加入含B(a)P培養基培養 24 h、傳代。反復染毒3次的細胞確定為第一代染毒細胞。未染毒細胞用同體積DMSO培養，方法同前。取傳至30代后的細胞檢測克隆形成能力、遷移能力和增殖活性。

①克隆形成能力：采用平板克隆形成實驗。細胞經胰蛋白酶消化后，200個/孔接種于6孔板，加入3 mL RPMI 1640培養基培養，5 d換液一次，培養2周。終止培養后棄上清，PBS清洗，甲醇固定20 min，吉薩姆染色10 min，干燥。鏡下計數多于 50 個細胞的克隆數，計算克隆形成率。克隆形成率=(克隆數/接種細胞數)×100%。

②遷移能力：采用劃痕實驗。用記號筆在6孔板背面畫5條間隔相等的橫線。細胞經胰蛋白酶消化后，1×106個/孔接種于6孔板，常規培養24 h后，使用槍頭垂直于橫線劃痕，PBS清洗，加入無血清培養基培養。于培養6、12、24、48 h后鏡下觀察并拍照，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析劃痕間距，記錄遷移距離。

③增殖活性：采用MTT實驗。細胞經胰蛋白酶消化后，5 000個/孔接種于96孔板，培養12、24、36和48 h后，避光加入5 g/L MTT溶液20 μL，培養箱中孵育4 h,棄上清，加入150 μL DMSO,搖床振蕩10 min,置于酶標儀中檢測490 nm處吸光度值。

1.3 差異表達miRNA的篩選用Trizol法提取染毒和未染毒細胞中的總RNA，用miRCRYTMArray Labeling試劑盒標記miRNA：將1 μg總RNA 樣品和1 μL CIP緩沖劑和CIP酶加入到 2 μL水中，混合均勻后，37 ℃放置30 min，95 ℃放置5 min。再加入3 μL標記緩沖液、1.5 μL免疫熒光雙標和2.0 μL的酶標記物，混合均勻后16 ℃孵育1 h，65 ℃孵育15 min。取25 μL樣品和25 μL雜交緩沖液混勻并于95 ℃變性2 min，冰上靜置2 min。將樣品置于芯片上，56 ℃反應16～20 h。用清洗液洗滌芯片，用生物芯片掃描儀掃描，對芯片進行標準化分析。以變化倍數(FC)≥2.0且P<0.05 為差異表達miRNA。

1.4 差異表達mRNA的篩選用Trizol法分別提取染毒和未染毒細胞中的總RNA。采用mRNA分離試劑盒去除tRNA，用RNA Flash Labeling試劑盒標記mRNA，使用SureHyb進行雜交。芯片洗滌固定后，再進行掃描雜交。使用GeneSpring軟件對芯片進行標準化處理，以FC≥2.0且P<0.05 為差異表達mRNA。對差異表達mRNA進行GO和KEGG分析。

1.5 細胞中hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521表達的檢測染毒和未染毒細胞融合至90%時，分別提取總RNA，加入2 μL的4×gDNA wiper Mix，2 μL的RNA模板混勻，42 ℃孵育2 min。加5×HiscriptRⅡRT SuperMix Ⅱ混勻；25 ℃孵育10 min，50 ℃孵育30 min，85 ℃孵育5 min；反轉錄成cDNA。取2 μL cDNA加入10 μL的AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(Low ROX Premixed)、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL和7.2 μL無酶水。擴增過程：95 ℃5 min預變性；95 ℃10 s,60 ℃30 s,40個循環；融解95 ℃15 s,60 ℃60 s,95 ℃15 s。用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。重復3次。引物由南京諾唯贊基因組研究中心有限公司合成，序列見表1。

表1 實驗用引物序列

1.6 統計學處理采用SPSS 21.0對數據進行分析，染毒和未染毒細胞各指標的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 惡性轉化BEAS-2B細胞模型的鑒定染毒、未染毒組平板克隆形成實驗結果見圖1，克隆形成率分別為(23.444±0.727)%、(0.889±0.601)%，染毒組大于未染毒組(t=41.420,P<0.001)。染毒組細胞增殖活性、遷移能力均強于未染毒組(圖2、3)，提示染毒組細胞發生惡性轉化。

圖1 未染毒(A)和染毒(B)組細胞克隆形成情況

圖2 未染毒和染毒組細胞增殖活性比較(*：P<0.05)

圖3 未染毒和染毒組細胞遷移距離比較(*：P<0.05)

2.2 差異表達mRNA與miRNA的篩選芯片表達譜見圖4。聚類分析結果顯示，染毒組和未染毒組細胞在不同的簇中，說明B(a)P染毒改變了細胞功能。共篩選出127種差異表達miRNA，其中29種表達上調，98種表達下調，前20位表達差異的miRNA見表2。共篩選出159種差異表達mRNA,其中99種表達上調，60種表達下調，前20位表達差異的mRNA見表3。

圖4 染毒和未染毒組細胞miRNA(左)和mRNA(右)的芯片表達譜

表2 前20位差異表達miRNA

表3 前20位差異表達mRNA

2.3 差異表達mRNA的GO和KEGG分析結果GO分析結果顯示，表達上調的差異表達mRNA主要涉及的生物學過程有組織器官生長發育、維持細胞金屬離子穩態和免疫應答等，涉及的細胞組分主要有反式高爾基體管網狀膜結構對蛋白質進行分選和轉運、MHC蛋白復合體、MHC 基因家族Ⅰ蛋白等，涉及的分子功能主要有抗原結合、細胞因子受體結合、受體活化等。表達下調的差異表達mRNA主要涉及的生物學過程有P38MAPK 級聯反應、正向調控細胞凋亡、負調控轉錄等，涉及的細胞組分主要有胞內膜結合細胞器構成細胞獨立的結構及功能、轉錄抑制復合物、通過膜結構相互協作等，涉及的分子功能主要有跨膜受體蛋白酶活性、雙鏈DNA結合及轉錄因子等。

KEGG分析結果顯示，表達上調的差異表達mRNA可能參與了細胞活素-受體相互作用介導的信號通路和Jas-STAT介導的信號通路，并且參與Toll樣受體介導的信號通路，通過TLR9來活化NF-κB和轉錄激活因子AP-1，釋放TNF-α因子從而發揮免疫監視功能；表達下調的mRNA可能參與了p53信號通路介導的細胞凋亡、周期阻滯和腫瘤血管抑制，TGF-β介導的抑制細胞分裂和Gadd45介導的DNA損傷修復等。

2.4 兩組細胞中hsa-miR-2115-3p 和hsa-miR-4521表達的比較針對miRNA芯片檢測結果，選取hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521進行驗證。PCR檢測結果顯示，染毒組細胞hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521表達水平均低于未染毒組。

表6 兩組細胞中兩種miRNA表達水平的比較

3 討論

B(a)P常常存在于汽車尾氣及化學制品中，是主要的大氣污染物之一，被國際癌癥研究機構IARC評為一級致癌物[11-12]。細胞模型是研究癌癥的重要手段。本研究用B(a)P對BEAS-2B染毒后，細胞克隆形成能力、遷移能力和增殖活性均明顯增強，提示成功構建了B(a)P誘導的惡性轉化細胞模型。

miRNA是非編碼蛋白的小RNA，通過堿基互補抑制翻譯或降解靶mRNA,調節mRNA的穩定性[13]。miRNA通過影響不同的mRNA參與細胞癌變的生物學過程[14]。研究[15]發現抑制miR-223-3p表達可以抑制JAK2、STAT3蛋白的表達，從而抑制胃癌細胞周期進展。Giordano等[16]以50歲為界限將88名肺腺癌患者分為兩組，發現7種差異表達miRNA。本研究發現，B(a)P染毒和未染毒的BEAS-2B有159種差異表達mRNA,其中99種表達上調，60種表達下調；有127種差異表達miRNA，其中29種表達上調，98種表達下調。對差異表達mRNA的GO分析結果顯示：表達上調的mRNA分子功能主要富集于受體活化、抗原結合和細胞因子受體結合等；細胞組分主要富集于蛋白質分類轉運、MHC蛋白復合體與抗原呈遞過程等；生物學過程主要富集于促進器官生長、免疫應答和維持金屬離子在細胞內的穩態等。表達下調的mRNA分子功能主要富集于影響跨膜受體蛋白酶活性、轉錄因子和雙鏈DNA結合等；細胞組分主要富集于胞內膜結合細胞器構成細胞獨立的結構及功能；生物學過程主要富集于調控P38MAPK級聯反應、調控逆轉錄和細胞凋亡。KEGG分析結果顯示：表達上調的mRNA可能參與了細胞活素-受體相互作用介導的信號通路等；表達下調的mRNA可能參與了p53信號通路介導的細胞凋亡、周期阻滯和腫瘤血管抑制等。本研究對染毒和未染毒細胞中hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521的表達水平進行檢測，結果染毒組均低于未染毒組，與芯片分析結果一致。

基因組不穩定性和突變是正常細胞轉變為癌細胞的基礎[17]。有研究[18]發現上調反式-7,8-二羥-9,10-環氧苯并芘誘導的惡性轉化的人支氣管上皮細胞中miR-542-3p表達水平，可降低細胞的增殖能力和惡性程度。生物信息學分析發現差異表達mRNA參與了脂肪積聚肝細胞的惡性轉化過程[19]。本研究發現B(a)P誘導惡性轉化的BEAS-2B中miRNA及mRNA表達譜發生顯著改變,差異表達miRNA及mRNA可能參與了細胞的惡變過程；發現的與惡性轉化相關的mRNA和miRNA將有助于發現新型分子標志或靶點，為B(a)P誘導肺癌的診斷和治療提供實驗基礎。