尼古丁通過α7亞型煙堿型乙酰膽堿受體影響牙周膜干細胞成骨分化實驗研究

劉 芬，朱 斌，翟 敏，葛 鑫，周志斐

(1.西安交通大學附屬西北婦女兒童醫院口腔科，陜西 西安 710061；2.西藏軍區總醫院口腔科，西藏 拉薩 850000；3.西安市人民醫院 西安市第四醫院口腔科，陜西 西安 710004)

牙周炎是一種導致牙周組織破壞的慢性疾病。若缺乏有效治療，將最終引起牙齒脫落[1]。牙周膜干細胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是一種在牙周膜組織中分離出的間充質干細胞亞群，在牙周組織再生中發揮著關鍵作用[2]。吸煙是牙周炎的重要高危因素[3]，其可能機制為：在尼古丁作用下牙周膜細胞分泌白細胞介素(IL)-8等炎性因子，破壞牙周組織的穩定結構[4]。α7亞型煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7 nAChR)是尼古丁的重要受體[5]。前期研究[6]已經表明該受體在大鼠和人的牙周組織中存在表達。因此，α7 nAChR所介導的信號通路可能是吸煙相關性牙周炎骨破壞的重要機制之一。研究[7-8]表明，在人牙槽骨成纖維細胞中尼古丁還能夠上調Wnt信號通路，且PDLSCs中Wnt信號通路的激活能夠抑制細胞的成骨分化。由此推測尼古丁通過表達于PDLSCs中的α7 nAChR影響下游Wnt通路，從而調節PDLSCs的成骨分化，本研究即對此進行觀察，希望能為吸煙相關性牙周炎的機制探索提供理論依據和實驗參考。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 自8例患者(12～23歲)獲取14顆因正畸需要而拔除的健康前磨牙和第三磨牙。PDLSCs的分離和培養按照前期研究開展[9]。牙齒用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗后自根中1/3刮取牙周膜組織。將牙周膜組織塊接種于6孔板，放置于37 ℃含有95%空氣和5% CO2的孵箱中培養。極限稀釋法挑選能夠形成單細胞克隆的細胞集落體外擴大培養PDLSCs。第2～4代細胞用于后續實驗。本研究獲本院倫理審查委員會批準通過。

1.2 免疫表型分析 按照前期文獻[10]描述的方法對PDLSCs進行干細胞表面標志物分析。取第3代5×105個PDLSCs孵育抗體1 h。藻紅蛋白發光的多克隆抗體有抗人CD146(批號：102419，Biolegend)、CD34(批號：119328,Biolegend)，CD31(批號：MA3100,eBioscience)。熒光素異硫酸發光的多克隆抗體有抗人stro-1(批號：340101,Biolegend)、CD105(批號：12-1057-42,eBioscience)、CD90(批號：45-0909-41,eBioscience)、CD44(批號：157107,Abcam)和CD14(批號：17-0141-81,eBioscience)。抗體孵育在4 ℃環境下避光進行。完成后磷酸鹽緩沖液清洗，流式細胞儀檢測。

1.3 PDLSCs成骨/成脂誘導分化 按照前期文獻[11]實驗步驟開展PDLSCs成骨/成脂分化誘導。6孔板每孔接種5×104個細胞。成骨誘導液中含100 nmol/L地塞米松(批號：D4902,Sigma)、50 μg/ml維生素C(批號：50-81-7,Sigma)和5 mmol/L β-甘油磷酸鈉(批號：G9422-10G,Sigma)。成脂誘導液中含有0.5 mmol/L甲基異丁基黃嘌呤(批號：I7018-100mg,Sigma)、0.5 mmol/L氫化可的松(批號：H0888-1G,Sigma)和60 mmol/L吲哚美辛(批號：I7378,Sigma)。定向誘導21 d后，用油紅O染液(批號：O0625-25G，Sigma)或2%茜素紅染液(批號：A5533-25G，Sigma)對誘導的細胞分別進行染色。

1.4 細胞增殖檢測(WST-1法) 利用WST-1細胞毒性分析試劑盒檢測尼古丁(批號：N3876,Sigma)對PDLSCs的毒性作用。96孔板每孔接種5×103個細胞，每孔含培養液100 μl。24 h后不同濃度尼古丁作用于細胞作為實驗組，以不加尼古丁干預的細胞為對照組。連續7 d在固定時間每孔加入10 μl WST-1試劑，避光孵育4 h。在450 nm波長下讀取每孔吸光度值。

1.5 RNA提取和實時定量PCR檢測 利用TRIzol試劑(批號：15596028,Invitrogen)提取PDLSCs總RNA。利用反轉錄試劑盒將所得RNA反轉錄為cDNA，反應體系3 μl。按照熒光實時定量PCR試劑盒說明配置PCR反應體系。本研究所用基因包括ALP、OCN、Runx2、BSP、β-actin，其中β-actin為內參。各基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.6 蛋白提取和Western blot檢測 蛋白裂解液提取PDLSCs總蛋白。定量試劑(批號：P0009,Beyotime)在595 nm波長下測量吸光度進行蛋白定量。Western blot檢測上樣體系為每泳道40 μg蛋白。Western blot檢測所用一抗包括抗人ALP一抗(批號：ab154100,Abcam)、抗人OCN一抗(批號：ab93876,Abcam)、抗人DKK1一抗(批號：sc-374574,Santa Cruz)、抗人BSP一抗(批號：sc-73634,Santa Cruz)、抗人Runx2一抗(批號：sc-390351,Santa Cruz)、抗人p-GSK-3β一抗(批號：sc-81496,Santa Cruz)、抗人α7 nAChR一抗(批號：sc-1447,Santa Cruz)、抗人β-catenin一抗(批號：D-10A8,Cell Signaling)、抗人GSK-3β一抗(批號：3D10,Cell Signaling)以及抗人活化β-catenin一抗(批號：05-665,Millipore)。

1.7 統計學方法 采用SPSS 16.0 統計學軟件分析處理數據。計量資料以均數±標準差的形式表示。采用雙尾非配對t檢驗比較兩組間數據差異。對于三組及以上數據差異，使用單因素方差分析比較，之后用Turkey檢驗進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PDLSCs分離與鑒定 PDLSCs能夠形成單細胞克隆(圖1A)。鏡下可見PDLSCs貼壁生長(圖1B)。體外定向誘導3周后，細胞出現成骨及成脂分化(圖1C、D)。流式細胞儀檢測結果顯示，PDLSCs間充質干細胞表面標志物CD44、CD90、CD105、CD146和Stro-1表達陽性，造血細胞標志物CD34、多核細胞標志物CD14及血小板內皮細胞標志物CD31表達陰性(圖1E)。

A：極限稀釋法挑選單細胞克隆集落(甲苯胺藍染色)；B：PDLSCs貼壁生長；C：成脂誘導21 d后油紅O染色；D：成骨誘導21 d后茜素紅染色；E：流式細胞儀檢測PDLSCs表面分子標志物表達情況

2.2 尼古丁影響PDLSCs形態并抑制其增殖 對照組PDLSCs細胞核清晰(圖2A)。10-3mol/L尼古丁作用24 h后，細胞內可見空泡樣改變(圖2B)。尼古丁濃度為10-4mol/L時，胞質內顆粒狀物質增多(圖2C)。當尼古丁濃度為10-5、10-6、10-7mol/L時，細胞形態改變不顯著(圖2D-F)。細胞增殖檢測結果提示10-3mol/L尼古丁作用后，PDLSCs增殖能力顯著下調(P<0.05)，10-7～10-4mol/L尼古丁作用后PDLSCs增殖能力同樣出現減退(P<0.05)，見圖2G。

A：對照組PDLSCs形態；B：10-3 mol/L尼古丁作用后PDLSCs可見空泡狀變性；C-F：10-7～10-4 mol/L尼古丁作用下可見胞漿內顆粒狀物質增加；G：PDLSCs增殖情況比較，與對照組相比，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

2.3 尼古丁通過激活α7 nAChR抑制PDLSCs成骨分化能力 在尼古丁(10-4mol/L)作用下，α7 nAChR表達進一步增強，而α7 nAChR特異性拮抗劑α-BTX(10-8mol/L)則能部分逆轉α7 nAChR表達上調趨勢(均P<0.05)，見圖3A、B。尼古丁濃度為10-4mol/L時，PDLSCs形成礦化結節的能力顯著下降，而此作用能夠被α-BTX部分逆轉(均P<0.05)，見圖3C、D。尼古丁作用14 d后qRT-PCR檢測發現，成骨相關基因ALP、OCN、BSP、Runx2表達顯著下降，加入α-BTX后尼古丁的抑制作用減弱(均P<0.05)，見圖3E。ALP、OCN、BSP、Runx2蛋白表達變化呈現類似趨勢(圖3F)。

2.4 尼古丁通過Wnt/β-catenin通路激活α7 nAChR抑制PDLSCs成骨分化 Western blot檢測發現，活化型β-catenin蛋白表達在尼古丁作用下上調，在α-BTX協同作用下表達減弱；Wnt通路抑制蛋白DKK1和GSK-3β在尼古丁作用后表達下調，加入α-BTX后尼古丁作用均減弱；磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)與GSK-3β變化趨勢相似(均P<0.05)，見圖4。而在DKK1(10 ng/ml)作用下，尼古丁對PDLSCs成骨分化能力的抑制作用得到逆轉，成骨分化相關基因ALP、OCN、BSP、Runx2及其蛋白表達變化呈現類似趨勢(均P<0.05)。

A：qRT-PCR檢測PDLSCs α7 nAChR基因表達情況；B：Western blot檢測α7 nAChR蛋白表達情況；C、D：茜素紅染色檢測PDLSCs在尼古丁和(或)α-BTX作用下形成礦化結節的能力；E：qRT-PCR檢測成骨分化相關基因變化(橫坐標由左向右依次為對照組、尼古丁、尼古丁+α-BTX、α-BTX)；F：Western blot檢測成骨分化相關蛋白變化。在A、D、E圖中，組間比較*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

圖4 Western blot檢測Wnt通路相關蛋白表達情況

3 討 論

吸煙可以影響牙周炎的發生與發展，表現為更加嚴重的牙槽骨吸收、牙周附著喪失和更深的牙周袋存留[12-13]。前期研究[5]已經證實煙草中的尼古丁能夠損傷牙周成纖維細胞，導致牙周治療預后不良。然而，現有研究多著眼于尼古丁的破壞作用，而對尼古丁抑制牙周組織再生關注較少。在本研究中，我們證實不同濃度尼古丁均可抑制PDLSCs成骨分化，其機制可能為尼古丁激活α7 nAChR后上調p-GSK-3β表達水平，調控Wnt信號通路。

PDLSCs具有一般間充質干細胞的特性。體內實驗[2]已經證實PDLSCs能夠分化形成成牙骨質樣細胞及牙骨質/牙周膜樣組織。類似結論在小型豬動物模型中也得到印證[14]。也有研究[15]表明，自小型豬獲得的PDLSCs能夠自體移植形成牙根-牙周膜復合結構，獲得類似天然牙的組織學形態。PDLSCs由于具有牙周組織再生潛能，是用于牙齒再生領域的理想種子細胞[16]。本研究同前期研究結果均表明吸煙者牙周再生療效較差的可能原因，即煙草中的主要毒性物質尼古丁破壞了PDLSCs的再生潛能。這一發現為將來的臨床治療提供了新的目標靶點。

α7 nAChR在機體免疫調節和炎性反應過程中扮演了重要角色[17]。在其特異性激動劑尼古丁作用下，可促進機體分泌乙酰膽堿，從而介導炎性反應[18]。此外，尼古丁還可與免疫細胞中的α7 nAChR直接結合，調控促炎因子如腫瘤壞死因子-α的表達，進而影響核因子-κB信號通路[19]。前期研究[5]提示α7 nAChR同樣表達于人牙周膜細胞，尼古丁通過激活該受體能夠上調促炎因子IL-1β的表達。還有研究[20]通過動物實驗發現尼古丁能夠導致實驗性牙周炎大鼠牙槽骨喪失。在此基礎上，研究[5]發現在大鼠牙周組織中存在α7 nAChR的表達，在尼古丁作用下該受體表達將上調。這些結果均提示，α7 nAChR在牙周炎發生與發展過程中可能發揮了破壞效應。本研究進一步證實，尼古丁同α7 nAChR結合后，PDLSCs成骨分化相關基因ALP、OCN、BSP和Runx2及其蛋白的表達均受到影響，提示PDLSCs中α7 nAChR在尼古丁對細胞成骨分化的負性調控過程中發揮了關鍵作用。

如前所述，α7 nAChR在炎性反應過程中發揮了重要作用[17]。在PDLSCs中，尼古丁正是通過該受體使得炎性因子表達上調，從而發揮相應破壞作用[5]。本研究結果還提示，在α7 nAChR同尼古丁結合后，受體下游Wnt通路發生激活，PDLSCs的成骨分化能力出現下調，而這一趨勢可以被Wnt通路抑制劑DKK1部分逆轉，表明α7 nAChR可能通過調節DKK1和下游GSK-3β的表達直接調控Wnt信號通路。然而，在后續研究中，我們仍需排除炎性因子在這一過程中可能發揮的間接作用。

綜上所述，α7 nAChR介導了尼古丁對PDLSCs成骨分化的負性調控。尼古丁作用下Wnt通路的激活參與了這一過程。這一發現同前期已經證實的Wnt通路能夠抑制PDLSCs成骨分化結論一致。在后續研究中，我們將更多關注α7 nAChR調控Wnt通路的機制。此外，非經典Wnt通路是否在這一調節過程中發揮作用也需加以證實。