右美托咪定對坐骨神經慢性壓迫損傷模型大鼠神經病理性疼痛的緩解作用及機制研究

王 瑗，馮建梅，衛白楊

(空軍軍醫大學唐都醫院麻醉科，陜西 西安 710038)

神經病理性疼痛指由于軀體感覺神經系統受到損傷或者出現疾病而導致的疼痛，臨床主要表現為自發性疼痛、痛覺過敏、異常疼痛以及感覺異常等。據統計，慢性神經病理性疼痛的發病率大約占到各種慢性疼痛的30%以上，是常見且難治的疾病之一[1]。高遷移率族蛋白B1(High mobility group protein B1，HMGB1)是一種病理性晚期的炎癥介質，在慢性神經病理性疼痛的發生及發展過程中具有關鍵性作用[2-3]。右美托咪定是特異性α2腎上腺能受體激動藥，與α2受體的親和力為可樂定的8倍。研究[4-5]表明，右美托咪定在其他各組疾病以及慢性神經病理性疼痛治療中表現出了良好的功效。本研究通過構建坐骨神經慢性壓迫損傷(Chronic constriction injury，CCI)大鼠模型，探究右美托咪定對坐骨神經CCI模型大鼠神經病理性疼痛的緩解作用，并探討可能的機制，以期為慢性神經病理性疼痛的治療提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠100只，體重230～250 g，購自中國醫學科學院動物所(北京華阜康生物科技有限公司)。室溫飼養，相對濕度控制在(50±5)%，12 h光照與12 h黑夜交替。每天正常自由飲水、進食并保持正?；顒?。適應環境1周后開始實驗。

1.2 主要試劑 右美托咪定(批號：20081232)購自江蘇恒瑞醫藥有限公司；戊巴比妥鈉(批號：190122)購自上?；瘜W試劑供應站分裝廠；羊抗兔一抗(批號：BA1011)、羊抗兔二抗(批號：BA1061)購自博士德生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、酶聯免疫吸附(ELISA)實驗試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.3 實驗分組 將100只大鼠隨機分為空白對照組、模型組、右美托咪定低劑量組(0.5 μg/kg)、右美托咪定中劑量組(1.0 μg/kg)和右美托咪定高劑量組(1.5 μg/kg)，每組10只。各組大鼠采用分籠飼養。

1.4 CCI模型構建 除空白對照組外，模型組、右美托咪定低劑量組、右美托咪定中劑量組和右美托咪定高劑量組均構建CCI模型。對大鼠的坐骨神經做結扎處理后將手術切口消毒處理，放回飼養籠內，直至大鼠逐漸復蘇。在模型構建成功后的第15天，再次向大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉，迅速取出大腦，分離海馬體，包裹于潔凈的錫紙內，液氮速凍后轉移至冰箱中-80 ℃保存待測。

1.5 觀察指標

1.5.1 各組大鼠HMGB1蛋白相對表達量比較：采用Western blot蛋白印跡法檢測各組大鼠HMGB1相對蛋白表達量。各組樣品均取20 μl進行上樣，用濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后使用PVDF膜完成轉膜。轉膜完成后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(羊抗兔IgG)孵育15 min，PBS清洗3次，加入二抗(羊抗鼠IgG)再次孵育15 min后曝光顯影。

1.5.2 各組大鼠海馬區TNF-α和IL-1β表達水平比較：按照1.5.1取蛋白樣品的方法，通過ELISA法測定大鼠海馬區TNF-α和IL-1β的表達水平。

1.5.3 各組大鼠海馬區HMGB1及其下游Toll樣受體4(TLR4)、RAGE mRNA相對表達水平比較：加入TRIzol提取大鼠海馬區的RNA，將RNA反轉錄成cDNA，并以此為模板，通過PCR法測定HMGB1及其下游TLR4、糖基化終產物受體(RAGE)mRNA的相對表達水平。以β-actin為內參照，按照2-△△CT法處理實驗數據。

2 結 果

2.1 各組大鼠HMGB1蛋白相對表達量比較 見表1。各組大鼠HMGB1蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與空白對照組比較，模型組和各右美托咪定劑量組HMGB1蛋白相對表達量均升高，尤以模型組為著(均P<0.05)。各右美托咪定劑量組與模型組相比，HMGB1蛋白相對表達量降低(均P<0.05)。

表1 各組大鼠HMGB1蛋白相對表達量比較

2.2 各組大鼠海馬區TNF-α和IL-1β表達水平比較 見表2。各組大鼠海馬區TNF-α和IL-1β表達水平比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。與空白對照組比較，模型組和各右美托咪定劑量組大鼠海馬區TNF-α和IL-1β水平均升高，尤以模型組為著。各右美托咪定劑量組與模型組相比，大鼠海馬區TNF-α和IL-1β水平降低，低劑量組對大鼠海馬區TNF-α和IL-1β水平的降低效果顯著小于中劑量組和高劑量組(均P<0.05)。右美托咪定中劑量組和右美托咪定高劑量組大鼠海馬區TNF-α和IL-1β表達水平比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。

2.3 各組大鼠海馬區HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相對表達水平比較 見表3。各組大鼠海馬區HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相對表達水平比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。與空白對照組比較，模型組和各右美托咪定劑量組大鼠海馬區HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相對表達水平均升高，尤以模型組為著。各右美托咪定劑量組與模型組相比，大鼠海馬區HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相對表達水平降低，右美托咪定低劑量組大鼠海馬區HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相對表達水平的降低效果顯著小于右美托咪定中劑量組和右美托咪定高劑量組。右美托咪定中劑量組和右美托咪定高劑量組大鼠海馬區HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相對表達水平比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。

表2 各組大鼠海馬區TNF-α和IL-1β表達水平比較(pg/mg)

表3 各組大鼠海馬區HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相對表達水平比較

3 討 論

目前，有關HMGB1在炎癥以及腫瘤的發生、發展中的研究較多，且近年來已經逐漸擴展到對慢性神經病理性疼痛的研究中。HMGB1在慢性神經病理性疼痛發生機制方面的研究仍然屬于新領域[6-8]。

研究[9-10]發現，大腦海馬區在處理慢性神經病理性疼痛信息中發揮著至關重要的作用。而慢性神經病理性疼痛患者的海馬區中，炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平都表現出升高的趨勢。HMGB1是重要的慢性神經病理性疼痛炎性介質。巨噬細胞、樹突狀細胞以及上皮細胞等在脂多糖和干擾素等因素的刺激下，會主動分泌HMGB1到細胞外，促使TNF-α和IL-1β等炎癥因子的釋放[11-13]。

右美托咪定自身具有高效及高選擇性，是一種α2腎上腺素受體激動劑，臨床證明其具有良好的鎮痛作用[14]。相關動物實驗[15]表明，在外周給予一定劑量的右美托咪定可以顯著提高慢性神經病理性疼痛大鼠的熱痛閾值。還有臨床研究[16]發現，對人體進行右美托咪定全麻處理能夠起到中等程度的鎮痛作用。本研究結果表明，模型組大鼠HMGB1蛋白、TNF-α和IL-1β、HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA表達水平均升高，右美托咪定各劑量組HMGB1蛋白、TNF-α和IL-1β、HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA表達水平均降低。在慢性神經病理性疼痛的炎癥早期，HMGB1能夠與其受體TLR4發生相互結合作用，激活體內的信號通路，引發炎癥介質不斷釋放[17-18]。在細胞炎癥因子的產生過程中，TLR4自身的活性會被中和，HMGB1誘導細胞因子產生的效應就會顯著降低，表明TLR4是HMGB1在慢性神經病理性疼痛促炎過程中發揮作用的受體，即TLR4作為HMGB1的重要受體參與了HMGB1的信號傳導過程，在慢性神經病理性疼痛細胞釋放炎性因子過程中HMGB1和TLR4同時發揮出了重要作用[19-20]。

有研究發現，病理性疼痛大鼠的脊髓組織中HMGB1和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性細胞明顯增多，TLR4、腫瘤壞死因子受體相關分子6(TRAF6)、磷酸化P65(p-P65)和 髓樣分化因子(MyD88)蛋白表達顯著增加，即HMGB1、星形膠質細胞和TLR4/NF-κB信號通路被激活。右美托咪定治療后，脊髓組織中HMGB1和GFAP陽性細胞數量以及TLR4、TRAF6、p-P65和MyD88蛋白表達均顯著減少，表明右美托咪定能減輕神經源性大鼠的疼痛，這種作用與HMGB1、星形膠質細胞活化和TLR4/NF-κB信號通路有關。HMGB1是調節神經系統炎癥反應的重要分子。在生理條件下，HMGB1與核內組蛋白結合，在維持DNA轉錄穩定性方面起著關鍵作用。經病理刺激后，可從細胞核轉移到細胞質中，從而激活TLR4和核因子-κB(NF-κB)相關信號通路，并在下游炎癥信號通路中釋放促炎因子。周圍神經損傷可導致脊髓小膠質細胞TLR4表達上調。當TLR4與相應受體結合時，可激活Toll/IL-1受體同源區，激活NF-κB相關信號通路，誘導多種炎癥因子的表達，促進多種細胞因子的釋放，從而激活脊髓膠質細胞的熱痛覺過敏，最終引起神經性疼痛。星形膠質細胞對HMGB1敏感，因此星形膠質細胞和TLR4/NF-κB通路可能是HMGB1的重要下游調節因子。此外，右美托咪定預處理可通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路下調引起的炎癥過程，減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，而HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路與α2腎上腺素受體的激活有關。

綜上所述，右美托咪定可以減輕坐骨神經CCI模型大鼠的神經病理性疼痛，其機制可能與抑制HMGB1從而抑制星形膠質細胞活性和TLR4/NF-κB信號通路有關。