急性髓系白血病患者巨噬細胞移動抑制因子表達水平及其與療效、預后相關性分析

馬 兵，張麗紅，趙 丹，尹婉宜，沈 揚，董 雯，劉清池

(河北醫科大學第一醫院血液內科，河北 石家莊 050031)

急性髓系白血病(Acute myeloid teukemia，AML)是一種因髓系造血干細胞改變并導致原始和幼稚髓細胞比例異常變化的惡性腫瘤[1]。流行病學研究[2]顯示，AML發病復雜，與環境、遺傳、化學物質接觸等均有關，占成年急性白血病的80%～90%，且男性發病率更高。目前，臨床治療AML仍以化療及造血干細胞移植為主，但治療后完全緩解(Complete remission，CR)僅為50%～70%，預后較差[3]。另外，大約50%的AML患者染色體檢查正常，但預后卻存在較大差異，5年內生存率為24%～42%[4]。基于此背景，從分子遺傳學角度探究AML發病機制，對患者治療方案的調整及預后改善均具有重要意義。巨噬細胞移動抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor，MIF)屬于免疫調節因子的一種，可廣泛參與人體炎癥釋放、氧化應激、腫瘤形成等病理過程[5]。現臨床上針對MIF與冠心病、腎癌、慢性阻塞性肺疾病等疾病的關系已有報道[6-8]，但其與AML患者預后的相關性研究尚無確切定論。因此，本研究探討AML患者MIF表達水平與預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年9月至2019年9月收治的急性髓系白血病(AML)初診患者132例，其中男性81例，女性51例；年齡31～57歲，平均(42.15±5.46)歲；美國西南腫瘤協作組(SWOG)分型中，良好42例，中危52例，高危38例；美國和英國協作組(FAB)診斷標準分型中，M1型12例，M2型58例，M4型40例，M5型22例；骨髓幼稚細胞比例<60%者56例。病例納入標準：①符合《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中國診療指南(2017年版)》[9]中AML診斷標準，并經骨髓細胞學、免疫分型、遺傳學等檢查確診；②自愿簽署知情同意書；③臨床各項檢查資料完整；④年齡≥18歲；⑤初次確診為白血病，并于我院接受柔紅霉素聯合阿糖胞苷化療誘導及中大劑量阿糖胞苷鞏固治療；⑥染色體核型正常。排除標準：①合并嚴重器官功能衰竭、全身免疫系統疾病、精神類疾病等；②合并其他惡性腫瘤；③合并活動性肺結核或其他器官感染；④哺乳及妊娠期婦女。本研究已通過本院醫學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 骨髓液及外周血標本采集：入組患者均于化療前無菌采集骨髓液3 ml，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，淋巴細胞分離液密度梯度分離單核細胞，然后以1500 r/min離心5 min，棄上清，-80 ℃保存待測。入院次日清晨采集空腹肘靜脈血5 ml，加入抗凝劑，以3000 r/min離心15 min，留上清，-80 ℃保存待測。

1.2.2 MIF表達水平檢測：取適量骨髓液及外周血標本，加入1 ml總RNA提取試劑TRIzol，混勻后靜置5 min。加入200 μl氯仿，再次震蕩后混勻并靜置5 min。室溫下12000 r/min離心15 min，取上層加入等量異丙醇溶液，震蕩混勻后靜置10 min，12000 r/min離心15 min，棄上層液體，加入75%乙醇溶液多次洗滌。待干后加入焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液溶解。采用美譜達UV-1800PC紫外可見分光光度計測定總RNA濃度及純度，以OD260/OD280在1.8～2.0為合格標準。于美國國家生物技術信息中心建立的DNA序列數據庫中檢索MIF序列引物，吸取2 μg總RNA，加入Oligo(dT)再生溶液1 μl、Reaction Mix Easy溶液10 μl、Trans Script兩步法RT-PCR試劑1 μl，并加入去RNA酶水至20 μl，構成總反應體系。PCR參數為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，共30個循環，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)作為內參。基因引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.2.3 療效判定標準：參考《血液病診斷及療效標準》第3版[10]，貧血、發熱、出血等相關癥狀體征基本消失，男性患者血紅蛋白(Hb)水平≥100 g/L，女性患者Hb水平≥90 g/L，血小板(PLT)水平≥100×109/L，中性粒細胞絕對值(ANC)≥1.5×109/L，外周血標本檢測無白血病細胞，骨髓原始細胞比例≤5%，判定為CR；貧血、發熱、出血等相關癥狀體征有所改善，生化指標檢測中有1項及以上未達CR標準，5%<骨髓原始細胞比例≤20%，判定為部分緩解(PR)；臨床癥狀體征及生化指標均未達到以上標準，骨髓原始細胞比例>20%，判定為未緩解(NR)。有效=CR+PR，無效=NR。

1.3 觀察指標 比較不同臨床特征AML患者骨髓液和外周血中MIF表達水平，臨床特征包括年齡、性別、抗原類型[人類白細胞DR抗原(HLA-DR)、白細胞分化抗原(CD)34、CD33、髓過氧化物酶(MPO)、CD13]、骨髓原始細胞數；比較不同療效患者MIF表達水平；比較不同MIF表達水平患者無病生存期(DFS)；分析AML患者MIF表達水平與療效及預后的相關性。

2 結 果

2.1 不同臨床特征AML患者骨髓液和外周血中MIF表達水平比較 見表2。不同性別及抗原類型的AML患者骨髓液和外周血中MIF表達水平比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。≥45歲AML患者骨髓液及外周血中MIF表達水平均明顯高于<45歲患者，骨髓原始細胞數≥60%的AML患者骨髓液及外周血中MIF表達水平均明顯高于骨髓原始細胞數<60%的患者(均P<0.05)。

表2 不同臨床特征AML患者骨髓液和外周血中MIF表達水平比較(ng/ml)

2.2 不同療效AML患者骨髓液和外周血中MIF表達水平比較 見表3。治療有效患者骨髓液及外周血中MIF表達水平均明顯低于治療無效患者(均P<0.05)。

表3 不同療效AML患者骨髓液和外周血中

2.3 不同MIF表達水平AML患者DFS比較 以所有患者入院初診時MIF表達水平中位數為臨界值分為高表達組及低表達組。高表達組患者DFS平均(14.25±4.12)個月，低表達組DFS平均(17.56±5.24)個月。高表達組患者DFS低于低表達組(t=4.034，P<0.05)。

2.4 MIF表達水平與AML患者療效及預后相關性分析 見表4。Spearman相關性分析顯示，骨髓液及外周血中MIF表達水平與AML患者療效及DFS呈負相關(均P<0.05)。

表4 MIF表達水平與AML患者療效及DFS相關性

3 討 論

AML為高度異質性疾病，具有細胞增殖快、高侵襲性、預后差等特點[11]。近年來，隨遺傳及生物學技術的不斷發展，臨床對AML發病、細胞分化及生物學行為等的認知更為深入，但其發病機制仍無法詳細闡明[12]。炎癥介質相關表達蛋白可能參與白血病的發病進程，MIF作為其中一種，劉兵華等[13]發現其水平與冠心病患者冠狀動脈狹窄程度具有顯著相關性，認為MIF通過促進吞噬細胞對低密度脂蛋白的氧化作用而加速血栓形成，使得冠心病患者病情惡化。而江曉珍等[14]研究發現，MIF還可激活磷脂酰肌醇-3-激酶信號通路，促進膠質瘤細胞轉移，提示其可能參與腫瘤細胞的分化與增殖。

p53基因為人體抑癌基因的一種，為53 kDa的蛋白質，野生型可在促使癌細胞凋亡的同時控制其增殖分化[15]。但該基因極易突變，可在體外致癌因素誘導下突變，在化療、氧化應激、內環境改變等一系列生理應激后可激活，發揮致癌作用[16]。研究[17]發現p53基因突變可能與MIF的存在有關。方瑜等[18]認為宮頸癌患者MIF及p53基因表達呈協同作用，這也是MIF參與腫瘤發生與進展的主要原因。本研究結果顯示，不同性別及抗原類型的AML患者MIF表達水平相當，表明MIF在AML患者體內表達無性別差異，且不受抗原類型影響。而≥45歲AML患者骨髓液及外周血中MIF表達水平高于<45歲患者，骨髓原始細胞數≥60%的AML患者骨髓液及外周血中MIF表達水平高于<60%的患者，分析可能是因為MIF參與AML的發病與進展，另外骨髓間充質干細胞主要介導白血病細胞分化增殖，具有免疫調節特性，而中老年患者免疫功能下降，骨髓間充質干細胞功能更傾向于惡性生物行為，加重病情發展，導致MIF表達顯著升高。

MIF作為多重功能的細胞因子，具有調節糖皮質激素的生理活動、促進炎癥反應加劇、造成血管內皮損傷等作用[19]。研究[20]表明，其還可影響細胞分離，并參與癌基因誘導癌細胞的轉換過程。張娟娟等[21]發現AML患者MIF高度表達，并證實其可促進骨髓間充質干細胞大量表達白細胞介素-8，加重炎癥反應。但既往研究缺乏MIF與AML患者預后相關性的分析，本研究結果顯示，經規范化治療后療效好的患者骨髓液及外周血中MIF表達水平更低，且MIF高表達的AML患者DFS更低，表明MIF確實隨著AML疾病的進展而升高，與其預后具有一定聯系。而Spearman相關性分析顯示，骨髓液及外周血中MIF表達水平與AML患者療效及DFS呈明顯負相關。MIF的作用方式途徑繁多，可通過非經典胞吞、激活磷酸化細胞外信號調節激酶(ERK)1/2、阻止p53基因介導的細胞凋亡等發揮其生物學效應。MIF可參與體內免疫調節、促炎、細胞分裂等病理過程，阻止自然殺傷細胞對白血病細胞的溶解并加速細胞增殖，且MIF可由腫瘤細胞分泌生成，二者互相影響，加重病情惡化。

綜上所述，AML患者MIF表達水平較高，且與療效及患者預后呈負相關。早期檢測其表達情況可為臨床治療方案的制定提供可靠依據。然而，AML發病機制相當復雜，p53基因與MIF相互影響的具體機制尚有待進一步探究。