阿司匹林抗結直腸癌的作用機制的生物信息學分析

郎吉萍 戴秋月 呂 萍 郭志剛

南方醫科大學南方醫院(廣州 510515)

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，發病率在全球惡性腫瘤中位居第3 位，死亡率位居第2位。據估計，2018年全世界有超過180萬新發結直腸癌病例[1-2]。近年來由于飲食、環境、生活方式等因素的改變，我國的癌癥譜正在從發展中國家向發達國家轉變，結直腸癌的發病率呈逐年上升趨勢[3]?；及└唢L險人群的化學預防是目前最經濟、最現實可行的腫瘤預防途徑。近年來免疫細胞和炎性微環境為癌癥治療提供了新的策略。雖然這些新策略前景良好，但對于初級化學預防來說，大多數毒性太強和/或太昂貴，臨床上亟需更加經濟、較低毒性的初級化學預防策略。其中阿司匹林是目前最有前景的化學預防藥物之一[4-5]。

2003年《新英格蘭醫學雜志》報道阿司匹林可預防結直腸癌患者大腸腺瘤的復發，掀起了阿司匹林預防結直腸癌的研究熱潮[6]。近年來大量臨床流行病學、臨床研究發現，阿司匹林對結直腸癌具有潛在的一級預防作用，并且能夠降低早期腸癌根治術后患者的復發轉移風險[7-8]。心血管疾病預防試驗數據表明服用阿司匹林的心腦血管患者能夠有效降低結直腸癌的患病率[9]。體外實驗發現阿司匹林可以通過抑制結直腸癌細胞增殖和誘導凋亡，顯著減弱腫瘤生長[10]。2016年美國預防服務工作組在指南中首次推薦服用低劑量阿司匹林來預防結直腸癌[11]。隨后，美國國立綜合癌癥網絡指南也開始推薦阿司匹林用于結直腸癌根治術后的“輔助治療”，以達到腫瘤二級預防的目的。

雖然阿司匹林對于結直腸癌的預防作用得到了很大程度的認可，但其防治結直腸癌的分子機制仍尚未達成共識。目前討論最多的機制涉及抑制血小板中的環氧化酶(血小板假說)。然而抑制生長所需的非甾體抗炎藥濃度是抑制前列腺素合成所需濃度的10～100倍，這表明存在額外的細胞靶點[5-6, 12-14]。隨著測序技術的成熟以及大數據時代的到來，生物信息學分析展現出其獨特的優勢，藥物數據庫及多種公共基因表達譜數據庫為我們研究藥物作用新靶點提供了廣泛的平臺。本研究中，我們基于生物信息學方法，通過多種公共數據庫預測并分析阿司匹林防治結直腸癌的候選基因，探討阿司匹林抗結直腸癌的潛在作用靶點[15]。

1 材料與方法

1.1 確定阿司匹林直接作用靶蛋白

DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca/)是目前唯一將詳細的藥物(即化學、藥理和藥物)數據與全面的藥物靶標(即序列、結構和途徑)信息相結合的數據庫。在DrugBank 5.1.5中可查找到阿司匹林的分子信息及直接作用蛋白靶點(direct protein targats, DPTs)[16]。

1.2 構建阿司匹林DPTs的蛋白質-蛋白質相互作用網絡和信號通路分析

STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)是構建蛋白質互作網絡的經典在線工具[17]。通過STRING在線構建阿司匹林DPTs的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡，并對阿司匹林DPTs的KEGG信號通路進行分析。

1.3 預測與癌癥有關的阿司匹林DPTs相互關聯的基因

通過STRING構建與癌癥有關的阿司匹林DPTs相互關聯的基因的PPI網絡。設定物種為人種，設置直接及間接關聯均不超過50個，篩選出最高置信度(得分0.900)的靶點，并用Cytoscape軟件可視化[18]。

1.4 分析阿司匹林DPTs在結直腸癌中的基因組學數據

cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)可探索多維癌癥基因組數據[19]。OncoPrint是一個可視化基因在腫瘤樣本中突變、拷貝數、表達情況的工具[20]。為了進一步了解 6個與癌癥相關的阿司匹林DPTs(EDNRA，IKBKB，NFKB2，NFKBIA，PTGS2，TP53)在結直腸癌患者中的基因特征，我們通過cBioPortal數據庫分析這些基因在結直腸癌患者中的表達改變，并用OncoPrint可視化。其中EDNRA，IKBKB，NFKB2，NFKBIA，PTGS2和TP53及結直腸癌作為限定條件。

1.5 確認阿司匹林抗結直腸癌的潛在作用靶點

GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是公共基因表達譜數據庫。選擇GEO數據庫中的4個結直腸癌表達譜芯片GSE9348(T=70、N=12)[21]、GSE21510(T=123、N=25)[22]、GSE32323(T=17、N=17)[23]、GSE21815(T=132、N=9)[24]，獲取上述芯片的標準化數據Series Matrix File(s)，并將芯片數據按照腫瘤組織及正常組織進行分組，應用R 3.6.1軟件的limma 函數進行差異表達分析，參數選擇|log2FC|>1，FDR<0.05，篩選結直腸癌和正常組織間的差異表達基因，將4個芯片數據差異分析的結果用韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進行整合，獲取差異表達數據中相同的基因。利用Cytoscape軟件篩選中心度最高的20個結直腸癌差異表達基因作為Hub基因(記為A組)；用STRING分析得到DPTs相互關聯基因(記為B組)。將以上兩組數據求交集，確認阿司匹林抗結直腸癌的潛在作用靶點。GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是一個新開發的用于癌癥和正常基因表達譜分析的公共數據庫[25]。利用GEPIA進一步驗證阿司匹林抗結直腸癌的潛在作用靶點在TCGA數據庫結腸腺癌樣本中的表達情況。

1.6 阿司匹林抗結直腸癌潛在靶點的基因本體論分析和KEGG通路分析

基因本體論(gene oncology，GO)分析包括生物過程、分子功能或細胞成分分析。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)是系統分析基因功能，聯系基因組信息和功能信息的知識庫。利用R 3.6.1軟件enrichGO、enrichKEGG包進行GO分析和KEGG通路分析并可視化，對阿司匹林抗結直腸癌潛在靶基因進行功能注釋。

1.7 細胞培養

人結腸癌細胞株HT-29由含10% FBS的1640培養基培養，經0.25%胰蛋白酶消化傳代，置于37 ℃，5% CO2的細胞培養箱培養。實驗組和對照組分別用阿司匹林和等量DMSO處理。

1.8 RT-PCR檢測HT-29中CDK1，AURKA，CCNB1，MAD2L1，TPX2的mRNA水平

將HT-29細胞分為4組，分別經 0、2、4、8 mmol/L阿司匹林處理48 h，用Trizol試劑提取HT-29總RNA，純化后用紫外分光光度儀檢測RNA濃度，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成 cDNA。利用染料法(SYBR Green I)將反應體系進行定量PCR分析，GAPDH作為內參。引物由上海生工公司設計并合成。引物序列：CDK1上游：TGGGAAGTTGGTAGCTCTGAA，下游：CCAGGGTGCTTGTCCATGTA；AURKA上游：TTGGGTGGTCAGTACATGCTC，下游：GTGAATTCAACCCGTGAT；CCNB1上游：GCACT-TTCCTCCTTCTCA，下游：CGATGTGGCATACTTGTT；MAD2L1上游：GTTCTTCTCATTCGGCAT-CAACA，下游：GAGTCCGTATTTCTGCACTCG；TPX2上游：ACGGGCTGTGACCTGCAAAAGT，下游：AGCCAATAGGCTCGGTGGGTGG；內參上游：TGTGGGCATC-AATGGATTTGG，下游：ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。2-△△ct法計算CDK1，AURKA，CCNB1，MAD2L1，TPX2的mRNA相對表達量。

1.9 WB檢測HT-29中CDK1，AURKA，CCNB1，MAD2L1，TPX2的蛋白表達水平

將HT-29細胞分為4組，分別經 0、2、4、8 mmol/L阿司匹林處理48 h。去除培養基，PBS洗細胞3次。用預冷的RIPA裂解液裂解30 min后，BCA試劑盒檢測蛋白質濃度。取40 μg進行電泳、轉膜和封閉，孵育相應的一抗和二抗后用ECL發光法分析各蛋白的表達量，以GAPDH為內參。

2 結 果

2.1 阿司匹林直接作用靶蛋白

阿司匹林(乙酰水楊酸)為弱酸性小分子藥物，其主要應用于解熱、鎮痛、抗血小板聚集等方面。在DrugBank 5.1.5中共查找到11個阿司匹林的DPTs(PTGS1，PTGS2，AKR1C1，PRKAA1，EDNRA，IKBKB，TP53，HSPA5，RPS6KA3，NFKBIA，NFKB2)，見表1。

表1 DrugBank數據庫中阿司匹林的直接作用靶點

2.2 阿司匹林DPTs的PPI網絡與KEGG通路分析

利用STRING構建了11個阿司匹林DPTs的PPI網絡與KEGG通路分析(圖1、表2)。阿司匹林DPTs主要富集的KEGG信號通路包括NF-κB信號通路，神經營養因子信號通路，胰島素抵抗信號通路，腫瘤信號通路，小細胞肺癌信號通路。其中6個阿司匹林DPTs(EDNRA，IKBKB，NFKB2，NFKBIA，PTGS2和TP53)富集在腫瘤信號通路中。

圖1 阿司匹林DPTs的蛋白質-蛋白質互作網絡

表2 阿司匹林DPTs主要富集的KEGG信號通路

2.3 預測6個阿司匹林DPTs相互關聯的基因

利用STRING的在線PPI分析預測6個富集于腫瘤信號通路的阿司匹林DPTs(EDNRA，IKBKB，NFKB2，NFKBIA，PTGS2，TP53)相關聯的基因，并用Cytoscape軟件可視化(圖2)。這些基因可能是阿司匹林抗腫瘤的潛在靶點。KEGG信號通路分析表明，這些基因主要富集于細胞周期，人類嗜T淋巴細胞病毒Ⅰ型感染，EB病毒感染，病毒性腫瘤，腫瘤等信號通路(表3)。

圖2 與EDNRA，IKBKB，NFKB2，NFKBIA，PTGS2，TP53相關聯的基因

表3 阿司匹林DPTs相關聯基因的KEGG信號通路

2.4 結直腸癌中6個阿司匹林抗腫瘤相關靶點的基因特征

為進一步了解6個阿司匹林抗腫瘤相關靶點的表達變化及功能，我們利用cBioPortal檢測了EDNRA，IKBKB，NFKB2，NFKBIA，PTGS2和TP53在結直腸癌患者中的腫瘤基因組改變(圖3A)。OncoPrint可視化結果表明在3項人結直腸癌研究中(DFCI研究[26]、TCGA研究和Genentech研究[27])，EDNRA，IKBKB，NFKB2，NFKBIA，PTGS2和TP53 6個基因的變化范圍在0.2%到37%之間，其中TP53發生變化比例最大。489例患者(37%)至少有一種 EDNRA，IKBKB，NFKB2，NFKBIA，PTGS2和TP53發生改變。其中EDNRA的改變表現為錯義突變；PTGS2的改變表現為錯義突變和基因擴增；TP53、NFKB2的改變表現為錯義突變，截短突變，純和缺失；IKBKB的改變表現為基因擴增，純和缺失，錯義突變和截短突變；NFKBIA的改變表現為基因擴增，純合缺失和錯義突變(圖3B)。

圖3 cBioPortal數據庫結腸腺癌研究中6個阿司匹林DPTs(EDNRA，IKBKB，NFKB2，NFKBIA，PTGS2和TP53)的遺傳改變

2.5 確定結直腸癌的差異表達基因

利用R3.6.1軟件對GEO中4個結直腸癌表達譜芯片數據進行差異分析并用火山圖可視化(圖4)。使用韋恩圖將上述結果進行整合，結果顯示在 4個芯片中，共有606個差異表達基因，表達上調的基因265個，表達下調的基因341個(圖5)。其中包括參與細胞分裂周期的基因如CDC25B、CDCA7、GTF2IRD1等，與細胞粘附功能相關的分子 CDH3、CLDN1等，參與腫瘤轉移的基質金屬蛋白酶家族分子MMP1、MMP3、MMP7、MMP12等。利用Cytoscape軟件篩選中心度最高的20個結直腸癌差異表達基因作為Hub基因(圖6)。

圖4 GSE9348、GSE21510、GSE32323、GSE21815基因表達譜火山圖

圖5 4個基因表達數據集的韋恩圖

圖6 結直腸癌TOP 20 Hub基因

2.6 預測阿司匹林抗結直腸癌潛在靶點

通過比較20個結直腸癌Hub基因與腫瘤相關的6個阿司匹林DPTs相互關聯的基因，我們發現兩組中有5個基因(CDK1，AURKA，CCNB1，MAD2L1，TPX2)共同表達，其可能是阿司匹林抗結直腸癌的潛在靶基因(表4)。GEPIA在線工具表明其在TCGA數據庫結腸腺癌樣本中的表達水平均上調(圖7)。

圖7 阿司匹林抗結直腸癌的潛在靶基因在TCGA數據庫結腸腺癌樣本中的表達情況

表4 結直腸癌TOP 20 Hub基因與阿司匹林DPTs相關聯基因的交集

2.7 分析阿司匹林抗結直腸癌的潛在靶點

對這5個阿司匹林抗結直腸癌潛在靶點的GO富集分析表明其主要參與細胞周期時相轉換的調控、微管細胞骨架的組成、有絲分裂細胞周期時相轉換的調控等生物學過程，其中CDK1，CCNB1，AURKA，MAD2L還參與有絲分裂細胞周期檢查點和細胞周期末期促進復合物依賴的分解代謝過程。KEGG富集分析表明這些靶點主要富集在與細胞周期調控相關的信號通路(圖8，圖9)。研究發現，細胞周期調控異常是細胞癌變和腫瘤發生的重要原因，細胞骨架與腫瘤的侵襲轉移密切相關。這提示這些潛在靶點可能通過以上方式對腫瘤的發生、發展產生影響。

圖8 阿司匹林抗結直腸癌的潛在靶點的GO富集分析

圖9 阿司匹林抗結直腸癌潛在靶點的KEGG通路分析

2.8 RT-PCR、WB結果

為進一步驗證生物信息學分析的阿司匹林抗結直腸癌增殖的潛在靶點，我們用RT-PCR和WB分別檢測了不同濃度阿司匹林處理48 h的HT-29細胞中CDK1，AURKA，CCNB1，MAD2L1，TPX2的mRNA和蛋白表達(圖10、圖11)。阿司匹林可以下調上述5個基因的mRNA和蛋白表達，且呈劑量依賴性。

圖10 阿司匹林作用于HT-29 48h后CDK1，AURKA，CCNB1，MAD2L1，TPX2的mRNA相對表達(**P<0.01)

圖11 阿司匹林作用于HT-29 48 h后CDK1，AURKA，CCNB1，MAD2L1，TPX2的蛋白表達水平(**P<0.01)

3 討 論

結直腸癌是常見的消化道腫瘤，嚴重影響人類健康。臨床上亟需新的防治方法以減少疾病負擔、提高患者存活率及生存質量。近年來大量研究表明阿司匹林對結直腸癌具有潛在的一級預防作用，并且能夠降低早期腸癌根治術后患者的復發轉移風險。本研究基于生物信息學，通過多種公共數據庫發現了阿司匹林與癌癥相關的6個DPTs及其相關聯基因，并得到阿司匹林抗結直腸癌的5個潛在作用靶點(CDK1，AURKA，CCNB1，MAD2L1，TPX2)。并通過RT-PCR、WB法進一步分析驗證了阿司匹林作用HT-29細胞后5個潛在作用靶點(CDK1，AURKA，CCNB1，MAD2L1，TPX2)的表達。與我們的研究一致的是，已有研究報道這5個基因在結直腸癌中起重要作用。

CDK1是調控G2-M關鍵節點的重要基因。CDK1在結直腸癌患者癌癥組織中高表達，且研究發現CDK1核漿比≥1.5可作為結直腸癌獨立危險因素，其核漿比越高，患者預后越差[28]。結直腸癌中10%的患者發生BRAF基因V600E突變，預后很差。維羅非尼是一種BRAF V600E抑制劑，但對結腸癌沒有明顯的抑制作用。研究表明CDK1會激活誘導維羅非尼耐藥[29]。近年來研究發現阿司匹林代謝產物及其衍生物對CDK1酶活性有抑制作用，阿司匹林可能通過抑制CDKs對大腸癌起化學預防作用[30]。

研究表明，TPX2(20q11)和AURKA(20q 13.2)是位于染色體20q的不同區域的兩個基因，它們促進了20q擴增驅動的大腸腺瘤向癌的進展。TPX2和AURKA的下調可抑制細胞的侵襲[31]。長期以來，MYC癌基因一直被認為是包括結直腸癌在內的許多類型人類癌癥的主要驅動因素。AURKA和TPX2與MYC位點呈現頻繁的共擴增，而MYC及其兩個基因的表達水平在多種癌癥類型中與MYC下游靶基因的表達水平呈正相關。此外，AURKA或TPX2的敲除或AURKA特異性抑制劑的治療有效地抑制了MYC表達的大腸癌細胞的增殖。MYC、AURKA和TPX2的聯合高表達被證明是結直腸癌患者生存的不良預后指標[32]。

CCNB1是細胞G2/M檢查點有關的重要細胞周期調控因子。它的一個重要角色就是調節CDK1并與之形成復合體后使底物磷酸化，啟動細胞從G1/S期進入G2/M期，并促進有絲分裂。越來越多的證據表明CCNB1參與了細胞周期檢查點的控制，它的功能障礙是腫瘤發生中的早期事件[33]。結直腸癌細胞中高表達的CCNB1可促進腫瘤細胞增殖和腫瘤生長，下調CCNB1的表達可抑制結直腸癌細胞增殖、誘導細胞周期G2/M期阻滯和促進腫瘤細胞凋亡。研究發現阿司匹林可使腫瘤細胞中的CCNB1表達下調，從而抑制細胞增殖[34]。

MAD2L1是調控細胞有絲分裂的關鍵分子，是結腸特異增殖相關基因，它在結直腸癌細胞周期的活躍期和結腸隱窩中高度表達[35]。研究發現MAD2L2的過表達可抑制CRC細胞的增殖，遷移和克隆形成[34]。紡錘體組裝檢查點已被確定為驅動非整倍體的重要機制，異倍體在結直腸腫瘤的發生中頻率很高。紡錘體組裝檢查點的兩個重要組件是MAD1L1和MAD2L1，它們以交互方式協同工作以啟動檢查點信號。MAD1L1和MAD2L1結合域中的遺傳變異可能調節蛋白質結構，最終導致大腸癌易感[36]。

總而言之，這5個基因與結直腸癌發生、發展有關(表5)。通過生物信息學我們預測它們是阿司匹林抗結直腸癌的潛在作用靶點，并推測阿司匹林可能通過影響細胞周期等方式起到抗結直腸癌作用。我們的研究結果為分析阿司匹林抗結直腸癌的分子機制提供了新的線索，為今后的實驗研究奠定基礎。

表5 阿司匹林對潛在作用靶點的影響及靶點基因在結直腸癌中的臨床意義

在大數據背景下，生物信息學在醫學研究和臨床實踐中的重要性日益明顯，成為當前的熱點領域之一。此研究基于公共數據庫分析阿司匹林抗結直腸癌的潛在作用靶點，該方法能夠更加經濟、靈活的預測藥物治療疾病潛在的靶點基因。然而，此方法也存在一定的局限性，其主要依賴于數據庫的完整性。近年來非編碼RNA與疾病進展的關系成為研究熱點，其也是一類重要的藥物靶點。本研究的不足在于未發現阿司匹林可以作用的非編碼RNA[37]。相信數據庫的不斷完善有助于我們對非編碼RNA與藥物靶點的研究。總之，生物信息學分析提供了一個便捷的方法，可用于預測藥物治療疾病潛在的靶點基因，為研究藥物在疾病預防和治療中的作用提供新的思路。