CCT亞基γ在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義

李剛，高天生，黎騁，李冬梅，梁偉，黃卓

(梧州市紅十字會醫院，1.腫瘤科，2.病理科，3.院感科，廣西 梧州 543002)

鼻咽癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，好發于鼻咽黏膜處。現階段治療手段較之前已取得較大的進步，然而仍有部分患者治療后存在復發和轉移風險，預后并不理想[1]。隨著現代分子生物學的不斷發展，基因的檢測及靶向診治已成為現代學者研究的焦點[2-3]。伴侶蛋白攜帶t復合多肽1(chaperones carry T complex polypeptide 1，CCT)作為分子伴侶素，在哺乳動物中由7～9種不同的亞基組成，且每個亞基的病理生理作用存在一定差異[4]。有研究[5]報道，CCT亞基γ與惡性腫瘤患者腫瘤細胞分化程度相關。但目前國內外尚未見有CCT亞基γ和人鼻咽癌關系的研究報道。本研究首次通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)、免疫組化及免疫印跡法檢測人鼻咽癌組織及鼻咽粘膜慢性炎組織中CCT亞基γ表達情況，初步探討CCT亞基γ與鼻咽癌患者臨床病理特征的關系及對預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象 選擇2012年5月至2017年6月梧州市紅十字會醫院隨訪資料完整的的活檢術標本，所有標本均經過病理試驗證實，包括100例鼻咽癌患者的癌組織(鼻咽癌組)和60例鼻咽黏膜慢性炎患者的炎癥組織(鼻咽黏膜慢性炎組)。鼻咽癌組中，男性72例，女性28例；年齡19～76歲，平均(45.10±9.12)歲。鼻咽黏膜慢性炎組中，男性46例，女性14例；年齡17～78歲，平均(45.52±8.06)歲。本研究經院醫學倫理委員會批準，研究對象均已簽署知情同意書。鼻咽癌納入標準：(1)所有鼻咽癌患者均經過病理活檢診斷證實，并符合鼻咽癌診斷標準[6]；(2)均為初發鼻咽癌患者；(3)在本次確診前未接受過放化療等抗腫瘤手段。排除標準：(1)臨床資料不齊全；(2)精神異常或認知功能障礙者；(3)患其他惡性腫瘤者；(4)患有嚴重感染性及內科疾(心肝腎肺腦等)病者。

1.1.2 主要儀器與試劑 PrimeScript RT(貨號：RR037A)和SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒(貨號：RR820A)均購自寶生物工程(大連)有限公司；CCT亞基γ(貨號：7203)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(貨號：113444562)引物交由上海生工生物工程有限公司，使用primer premier5.0軟件設計；蛋白提取試劑盒(貨號：R0050)及紫外分光光度計(型號：UV-1500)均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人CCT亞基γ抗體(貨號：10571-1-AP)和兔抗人GAPDH抗體(貨號：10494-1-AP)購自Proteintech公司，山羊抗兔二抗(貨號： A21020)購自艾美捷科技有限公司；BCA試劑盒(貨號：23227)購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測 通過TRlzol法提取各組織標本中總RNA，具體操作如下：取咽癌組織和鼻咽黏膜慢性炎組織50～100 mg，加入1 mL的TRlzol，對組織剪碎及勻漿，再加入氯仿，高速離心分離后，將上層(含有RNA的無色水樣層)移至新的EP管中，經0.5 mL異丙醇處理，高速離心分離，棄上清，加入75%乙醇1 mL處理，高速離心分離，棄上清，室溫晾干，再加入20 μLDEPC水溶解，促溶后-80℃保存待用。利用Nanodrop法對RNA濃度、純度進行定量，將RNA逆轉錄合成cDNA：逆轉錄體系為10 μL，反應條件設置為：37 ℃，15 min×3次，85 ℃ 條件下5 s。CCT亞基γ(擴增片段大小117 bp)上游引物序列：5’-GCAAGTGTGCCGCAATGTTCTACT-3’；下游引物序列：5’-TGTTCCACACCAGTCATGGCCTTA-3’。GAPDH(擴增片段大小115 bp)上游引物序列：5’-TCAACAGCAACTCCCACTCTTCCA-3’；下游引物序列：5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCA-3’。實施熒光定量PCR操作，總反應體系為20 μL：SYBR Green Premix10 μL，上游和下游引物各1 μL，2 μL模板，6 μL去離子水。CCT亞基γ反應條件設定為：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40個循環。利用2-ΔΔCt法計算CCT亞基γ的相對表達水平。

1.2.2 免疫印跡檢測 將各組織標本剪碎并在勻漿器中進行勻漿，加入裂解液于勻漿中進行勻漿，置于冰上，重復幾次后使組織盡量碾碎，裂解0.5 h后將裂解液轉移至離心管中，離心分離組織總蛋白。定量上清液蛋白，加上樣緩沖液，沸水浴10 min，予以10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉PVDF膜，5%脫脂牛奶密封2 h，添加CCT亞基γ一抗(稀釋1∶500)、GAPDH (稀釋1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，沖洗后，將相應二抗(稀釋1∶5 000)與PVDF膜室溫下孵育1 h。ECL暗室曝光顯影，利用圖像掃描采集圖片數據(蛋白條帶灰度值)，蛋白相對表達量=灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.3 免疫組化檢測 將各組織標本于10%的甲醛中固定，進行切片脫蠟和復水，將切片放置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，沸水浴20 min進行抗原修復，將抗原修復的石蠟切片冷卻至室溫，通過雙蒸水浸泡10 min后，吸去切片表面雙蒸水，在10%山羊血清中室溫孵育30 min。吸去山羊血清，加CCT亞基γ一抗(稀釋1∶50)，4 ℃孵育過夜，吸去一抗，沖洗三遍。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋1∶200)，孵育1 h，沖洗3遍后，顯色封片。通過SDX-100倒置顯微鏡進行攝片，免疫組化染色結果根據染色強度及陽性率進行判斷，其中染色強度為顏色從無色逐漸加深至棕褐色，表明染色度越明顯，CCT亞基γ陽性表達越明顯。CCT亞基γ陽性表達率=CCT亞基γ細胞個數×100%/總細胞，其中0分為陰性；陽性率1%～25%為1分；陽性率26%～50%為2分；陽性率51%～75%為3分；陽性率在76%～100%為4分[7]。

1.2.4 臨床病理特征分析 整理全部鼻咽癌患者臨床資料，根據CCT亞基γ 蛋白相對表達中位值將鼻咽癌患者分為高低表達組，其中超過CCT亞基γ蛋白相對表達水平中位值的患者納入高表達組，低于CCT亞基γ蛋白相對表達水平中位值的患者納入低表達組[8]，并分析CCT亞基γ不同表達水平與鼻咽癌患者年齡、性別、吸煙史、原發腫瘤局部淋巴結遠處轉移分期(distant lymph node metastases of the primary tumor，TNM分期)、復發、遠處轉移及病理分型等臨床病理資料之間的關系。對2012年至2017年期在本院診治的鼻咽癌患者，以電話、門診檢查等方式進行隨訪，每次隨訪做好記錄，以病理確診日作為觀察起點，隨防至2021年6月，分析CCT亞基γ不同表達水平對患者生存情況的影響，記錄患者的3年總生存率。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CCT亞基γ mRNA的表達水平

RT-qPCR實驗結果顯示，鼻咽癌組CCT亞基γ mRNA相對表達水平高于鼻咽黏膜慢性炎組(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組織標本中CCT亞基γ蛋白表達情況

免疫組化及免疫印跡實驗結果顯示，鼻咽癌組CCT亞基陽性表達率評分及蛋白水平均高于鼻咽黏膜慢性炎組(P<0.05)，并根據CCT亞基γ蛋白相對表達中位值將鼻咽癌患者分為高表達組和低表達組，每組各50例。見圖2。

2.3 CCT亞基γ表達與鼻咽癌患者臨床病理資料之間的關系

CCT亞基γ蛋白表達水平與鼻咽癌患者的TNM分期、復發有關(P<0.05)，而與年齡、性別、吸煙史、遠處轉移及病理分型無關(P>0.05)。見表1。

表1 CCT亞基γ蛋白表達與鼻咽癌患者臨床病理資料之間的關系[n(%)]

2.4 CCT亞基γ基因表達水平對乳腺癌患者預后的影響

CCT亞基γ蛋白高表達水平患者3年總生存率為68.00%，低于CCT亞基γ低表達水平患者的92.00%(χ2=3.984，P=0.046)。見圖3。

3 討論

鼻咽癌是發病于鼻咽頂壁及咽隱窩的常見惡性腫瘤，全球發病率及死亡率較高，對放化療比較敏感，早期患者予以積極治療，生存預后尚可，而中晚期患者已出現腫瘤細胞局部浸潤及遠處轉移，往往患者預后不佳。因此，有必要探究鼻咽癌的發生發展的機制，尋找有助于鼻咽癌診治及預后判斷的新型腫瘤標志物。

分子伴侶素是一類能特異結合及釋放底物蛋白的蛋白分子，在原核細胞、真核細胞和古細菌中均有分布，主要以由8個不同的亞基排成的一個中空柱狀體CCT為代表。現代研究多集中于CCT亞基α與腫瘤發展機制的報道[9-10]，而關于CCT亞基γ在鼻咽癌組織中表達及其與患者病理特征和預后關系尚未見報道。近些年來，譚曉虹等[5]研究發現，伴侶素CCT亞基γ在肝癌組織中呈異常高表達水平，且與肝癌患者腫瘤細胞的分化密切相關，表明CCT亞基γ可能參與腫瘤的分子發病機制。

本研究結果顯示，鼻咽癌組CCT亞基γmRNA、陽性表達率評分及蛋白水平均高于鼻咽黏膜慢性炎組(P<0.05)，提示鼻咽癌組織中呈高表達水平，推測CCT亞基γ可能參與鼻咽癌的發生發展；其原因可能是有關上游非編碼RNA的CCT亞基γ靶基因，在鼻咽癌組織中呈低表達水平，進而靶向上調了鼻咽癌組織中CCT亞基γ表達。肖晶鑑[11]研究報道mir-24在鼻咽癌細胞中呈低表達水平，且已有研究[12]證實，mir-24與CCT亞基γ之間呈靶向負調控關系，進而mir-24低表達通過靶向上調CCT亞基γ水平起到參與癌細胞的增殖、侵襲及遷移。但具體分子生物學作用機制有待進一步深入研究。本研究臨床病理特征分析結果顯示，CCT亞基γ表達水平與鼻咽癌患者的TNM分期、復發有關(P<0.05)，而與年齡、性別、吸煙史、遠處轉移及病理分型無關(P<0.05)。TNM分期是反應鼻咽癌原發腫瘤侵犯程度、區域淋巴結轉移及是否發生遠處轉移的重要依據，而TNM分期III～IV期鼻咽癌組織中CCT亞基γ高表達占比較多，說明CCT亞基γ的高表達參與了鼻咽癌腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移，促進鼻咽癌患者病情的發生發展，并增加了患者治療后的復發風險。有研究[13-15]認為，CCT亞基γ的高表達可能會促進腫瘤細胞的有絲分裂及增殖，進而調控腫瘤的發生發展，對鼻咽癌的發生進展具有促進意義；其次CCT3誘導細胞內ROS和能量代謝中游離氨基酸的失衡來抑制腫瘤細胞凋亡的機制，進而促進腫瘤細胞增殖分化，參與疾病的進展[16]；另外，CCT3基因表達上調與絲裂原活化蛋白激酶激酶7、細胞分裂周期42、細胞周期蛋白D3上調、細胞周期蛋白依賴激酶2、6下調有關，進而對CCT3在腫瘤的發生發展中起著重要作用[17]。而譚曉虹等[5]研究則認為，CCT亞基γ的高表達水平與腫瘤分化程度有關，與腫瘤臨床分期、年齡等無關，原因可能與本研究納入病例不夠豐富、疾病種類不同及對每一例患者進行直接上門隨訪各種原因的限制等原因有關。后期研究值得進一步擴大樣本量，以及完善隨訪效果，以進一步明確CCT亞基γ與鼻咽癌病理發展的關系。

本研究還發現，CCT亞基γ高表達水平患者的3年總生存率為68.00%，低于CCT亞基γ低表達水平患者92.00%(P<0.05)，提示CCT亞基γ高表達水平預示鼻咽癌患者預后不良，原因可能是CCT亞基γ高表達水平促進鼻咽癌的疾病進展，進而縮短了患者的生存時間。同時臨床上通過檢測鼻咽癌組織中CCT亞基γ水平，有助于患者預后生存情況的評估。因此CCT亞基γ有望成為鼻咽癌臨床分期、復發及預后的生物學指標，對術前方案制定、術后輔助治療及預后評估具有一定的輔助指導價值。

綜上，CCT亞基γ在鼻咽癌組織中呈高表達水平，與鼻咽癌患者臨床分期及復發密切相關，CCT亞基γ水平的增高預示著患者預后不良。