不同位置的滋養層細胞與內細胞團分子核型的關系*

李成龍 ，葉洲杰，杜生榮,

（1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117；2.福建省婦幼保健院 福建醫科大學附屬醫院，福建 福州 350117）

近年來隨著科學技術在臨床應用中的進步，越來越多的家庭，尤其是有家族遺傳病的夫妻開始選擇體外受精-胚胎移植技術（in vitro fertilization&embryo transfer，IVF-ET）來避免后代出現先天缺陷的遺傳病。隨著體外受精-胚胎移植技術的不斷發展，對于胚胎基因的分析及質量的評估已經成為胚胎移植前重要的篩選參考。然而目前大部分胚胎移植主要以卵裂球數目、形態、胞漿顆粒、碎片數量等為參考依據，單純的胚胎形態學評分只能從表觀上預測胚胎的發育潛能，無法檢測胚胎是否帶有異常基因或染色體病等。

據目前國內的數據，輔助生殖臨床妊娠率為50%～60%之間，抱嬰率只有35%左右，而多數胚胎由于染色體異常導致早期妊娠丟失及流產。胚胎植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是目前對體外受精胚胎的染色體結構和基因遺傳病檢測的常用方法，借助二代測序技術，從細胞分子水平檢測胚胎的核型，篩選出優質的胚胎進行移植，可以有效地提高抱嬰率。囊胚中主要有內細胞團（inner cell mass，ICM）和滋養層細胞（tropheetoderm cell，TE）。目前，對處于囊胚期的胚胎進行囊胚活檢是最常用的方法，囊胚活檢主要是收集滋養層細胞，通過對滋養層細胞的基因及染色體分析來檢測胚胎是否正常，但是囊胚中的滋養層細胞的分布范圍較大，有的靠近內細胞團稱為ICM鄰側細胞，有的遠離內細胞團稱為ICM對側細胞，不同位置的滋養層細胞分子核型與內細胞團有無相關性？是否會影響胚胎診斷結果？本研究通過對囊胚不同位置的滋養層細胞活檢后進行染色體分析，更深入地了解植入前胚胎嵌合的發生，并更精準地服務臨床。

1 對象和方法

1.1 對象

收集不適宜移植、評分差的囊胚，且夫妻雙方染色體均正常。此項研究患者知情同意并經院倫理委員會同意。

1.2 方法

1.2.1 囊胚滋養層細胞和內細胞團活檢

用激光在透明帶打個小孔，通過顯微操作系統，從不同位置活檢囊胚滋養層細胞和內細胞團細胞，活檢后的細胞裝入PCR管，用于細胞全基因擴增。

1.2.2 細胞裂解

細胞裂解緩沖液（Cell Lysis Buffer）5 μL 與細胞裂解酶（Cell Lysis Enzyme）0.1 μL充分混勻，2.5 μL單細胞懸液加入其中，預熱PCR儀，孵育樣本。

孵育條件：50 ℃，50 min；80 ℃，10 min；4 ℃，長時間。

1.2.3 MALBAC預擴增

前擴增緩沖液（Pre-Amp Buffer）30 μL和前擴增酶（Pre-Amp Enzyme Mix）1 μL混合均勻，7.5 μL gDNA加入其中，短暫離心，充分混勻。

PCR 反應條件：94 ℃，3 min，1個循環；20 ℃、40 s，30 ℃、40 s，40 ℃、30 s，50 ℃、30 s，60℃、30 s，70℃、4 min，95℃、20 s，58 ℃、10 s，8個循環；4 ℃、長時間。

1.2.4 MALBAC擴增

擴增緩沖液（Amplification Buffer）30 μL和擴增酶（Amp Enzyme Mix）0.8 μL混勻，向37.5μL DNA中加入30 μL MALBAC擴增混合液，離心混勻。

PCR 反應條件：94 ℃、30 s，1個循環；94 ℃、20 s，58 ℃、30 s，72 ℃、3 min，20個循環；4 ℃，長時間。

采用Genomic DNA Clean&Concentrator試劑盒純化WGA產物，純化產物-20 ℃保存待用。

1.2.5 段化-連接反應

x μL WGA產物(50 ng)，5X Buffer H 2 μL，Buffer EB( 7.6 μL-x μL)，FL-2酶0.4 μL，反應體系共10 μL，孵育條件：55 ℃，10 min，孵育完畢后加入150 μL Buffer PB終止反應，并加入20 μL Buffer EB至180 μL。

1.2.6 文庫擴增

擴增反應體系：片段化-連接產物33.8 μL，5X KAPA2G Robust Buffer A 10 μL，2.5 mM dNTPs 4 μL，Index Primer Mix 2 μL，KAPA2G Robust DNA Polymerase 0.2 μL；擴增反應條件：72 ℃ 3 min，1個循環；95 ℃ 2 min，1個循環；95 ℃ 30 s，62 ℃30 s，72 ℃ 3 min，14個循環；4 ℃，長時間。Qingen純化試劑盒純化PCR擴增產物。

1.2.7 測序數據分析

將細胞中提取后擴增的全基因送億康基因測序分析。

1.2.8 統計學處理

采用spss25.0軟件處理數據。計數資料以例和百分數表示（%）。

2 結果

2.1 采樣細胞于滋養層細胞同側

體外受精的胚胎經過一段時間的培養后進入囊胚期，主要分為內細胞團和滋養層細胞（圖1 A），用激光在透明帶區打個小洞，顯微操作儀在囊胚中不同部位分別吸取細胞，然后進行核型分析。根據分析結果（圖1 B，C）可知，滋養層細胞TE1和TE2與內細胞團ICM測序結果一致，為46,XN。

圖1 人廢棄囊胚不同部位滋養層細胞（鄰ICM）測序結果

圖2人廢棄囊胚不同部位滋養層細胞（鄰ICM及對側）測序結果

2.2 采樣與滋養層細胞對側及鄰側

使用顯微操作儀對第二個囊胚上的不同部位吸取細胞（圖2 A），分析結果表明，TE2細胞的核型為46，XN -21(mos～30%)，而TE1、TE3以及ICM的核型結果一致為46,XN。

2.3 采樣與滋養層細胞隨機取

使用同樣的方法對第三個胚胎不同部位（圖3 A）進行檢測分析，分析結果（圖3 B）表明TE1的核型為46,XN,+16p(mos～40%)，其余細胞的核型與ICM一致為46,XN。

圖3 人廢棄囊胚多個位點滋養層細胞（鄰ICM及對側多處）測序結果

2.4 不同部位的滋養層細胞與內細胞團基因水平的一致性匯總

對所有囊胚活檢細胞與對應ICM細胞的檢測匯總發現，不同位置的滋養層細胞與內細胞團的分子核型存在差異，ICM對側滋養層細胞20個中，有18個細胞分子核型與內細胞團ICM一致，一致率為90%，而鄰側滋養層細胞28個中，有24個細胞與內細胞團ICM一致，為86%。可見，滋養層細胞的分子核型不完全與內細胞團一致。

表1 囊胚活檢細胞基因型與ICM比較

3 討論

受精卵發育成囊胚過程中，受精卵內的細胞由于分布位置不同，分化成兩種細胞，一類是內細胞團（Inner cell mass，ICM），未來發育成完整的個體；另一類是滋養層細胞（Tropheetoderm cell，TE），發育成胎盤。而胚胎植入前遺傳學診斷技術的應用，是通過活檢滋養層細胞代替內細胞團細胞來檢測胚胎染色體是否正常，從而減少對胎兒個體發育的干預。但是由于滋養層細胞存在染色體嵌合現象，判讀滋養層細胞異常核型或正常的核型與內細胞團細胞實際的分子核型不相符，誤診率大約4.3%[1]。

如何降低誤診率的發生也是目前國際難解決的問題，本研究檢測囊胚滋養層細胞不同位置的分子核型，以期提高胚胎的準確診斷率。活檢遠離內細胞團或者靠近內細胞團細胞，發現不同位置的分子核型有的與內細胞團細胞不相符，有的相符，因此活檢滋養層細胞的位置不能間接提高內細胞團分子核型的診斷準確性。Colls P等人研究卵裂期胚胎嵌合比率，至少兩個卵裂球是異常的，染色體的嵌合比率為30%[2]。而Capalbo A等人用FISH技術重新分析內細胞團和滋養層細胞的分子核型，嵌合比率低于卵裂期[3]。因此可以通過卵裂期繼續培養囊胚來降低嵌合比率的發生，提高診斷的準確率。但是通過活檢不同位置的滋養層細胞，并不能提高囊胚診斷準確率，滋養層細胞分子核型是隨機分布的，靠近內細胞團兩側細胞同樣有不同的分子核型。趙亮等人研究了人植入前囊胚滋養層細胞的空間表達，極滋養層細胞中306個基因上調而壁滋養層細胞只有75個基因上調，兩者基因表達存在差異性[4]。Munne S等人用FISH方法研究嵌合胚胎的發生機制，發現5%的非整倍體嵌合是由于有絲分裂后期延遲[5]。這意味著囊胚滋養層細胞就會出現正常的、單體型的、三體型的分子核型。根據Garrisi J等的分割實驗，嵌合體囊胚可以分割成不同的細胞系，即單體細胞系和三體細胞系[6]。由于滋養層細胞活檢是隨機的，不同位置的滋養層細胞分子核型與內細胞團的分子核型沒有一致性，檢測結果不能反映胚胎的分子核型，但這樣的胚胎在臨床上仍有應用價值。Bolton H等人以染色體嵌合老鼠為模型，發現非整倍體細胞通過凋亡模式消失，發育胎盤的細胞系有嚴重的增殖缺陷現象，但只要有充足的整倍體細胞，嵌合的胚胎仍然具有發育潛能[7]，2015年Greco E等人嘗試把無整倍體胚胎的18名患者，移植了嵌合比率為35%～50%的胚胎，結果誕生了6名染色體正常的嬰兒[8]，所以本研究認為滋養層細胞的分子核型并不能完全反應內細胞團的分子核型，滋養層沒有出現位置效應，在臨床實踐中，如有嵌合型的胚胎，嵌合比率低，仍然建議移植，增加胚胎的利用率。很多醫院還會增加一項產前診斷的檢查，通過對羊水中胎兒脫落細胞的收集分析來進一步確定胎兒的發育情況以及基因是否正常。

目前胚胎植入前遺傳學診斷篩查技術的應用，可以提高胚胎的種植率、妊娠率，但是對于假陰性和假陽性結果的出現還缺乏有效解決方法，本研究活檢不同位置的滋養層細胞，分子核型結果與內細胞團比較未見相關性，因此無法通過篩選滋養層細胞的活檢位置，來提高胚胎分子核型診斷的準確性，仍然需要多中心、多個測序平臺來提高檢測的準確性，更好地服務不孕不育夫婦。