線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞模型的改良技巧及效果研究*

趙舒蒙，王 丹，車文文，王松濤，邱繼文△

(1.西安翻譯學院健康與運動學院，陜西 西安 710105；2.天津中醫藥大學針灸推拿學院，天津 301617；3.天津中醫藥大學中醫學院，天津 301617)

流行病學研究顯示，腦卒中居人口死亡和致殘因素的榜首，發病率有逐年增高的趨勢，在不同程度上加重了社會、家庭及個人的生活和經濟負擔[1-2]。腦卒中分為缺血性卒中和出血性腦卒中，前者在臨床上尤為常見(約占70%)[3]，且好發于大腦中動脈(MCA)。

目前，對于缺血性腦卒中的主要實驗研究模型為大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。?ANAK?I等[4]認為大鼠因具有與人類相似的腦血管解剖結構與功能，易獲取、價格低等特點，所以被用于缺血性腦卒中實驗的病理生理學變化、發病機制和防治措施等相關機制研究。因此，對于建立能夠模擬人類缺血性腦卒中且可信度高、穩定性好、操作性強的動物模型必不可少。本文通過建立大鼠MCAO模型，研究改良后制作方法建立模型的成功率和存活率。

1 材料與方法

1.1材料 選取健康清潔級雄性SD大鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)30只，體重250～280 g，鼠齡2.5～3.0 月。分籠飼養，每籠5只，飼養溫度25 ℃，相對濕度60%，適應性喂養1周。

1.2方法

1.2.1自制石蠟線栓 將直徑 0.22 mm 的尼龍魚線切割成長 4.0 cm 的線栓，切面盡量平齊，避免形成銳利的邊緣和斜面。將線栓的一端和中間 2.0 cm 處用黑色記號筆進行標記。加熱熔化固體石蠟為液體，令石蠟液體逐漸冷卻直至液體表面將要凝固，此時將線栓記號筆標記的一端快速垂直浸入石蠟，然后快速提起，使線栓標記端表面凝固一薄層石蠟后在顯微鏡下觀察，篩選石蠟端光滑圓鈍、直徑約0.28 mm的線栓，去掉石蠟過短、粗糙、形狀不規則、未包裹住頭端的線栓。采用75%的乙醇對自制石蠟線栓進行消毒，將其浸泡于生理鹽水中備用。

1.2.2建立模型 本研究采用線栓法建立大鼠MCAO模型，建立模型前所有大鼠禁食不禁飲1 d。具體操作如下：在室溫條件下(25 ℃)，采用3%異氟烷混合30%氧氣和70%空氣，通過小動物麻醉機(公司：Midmark，型號：Matrx VMR)進行誘導麻醉，見圖1A。采用2%的異氟烷面罩維持麻醉，見圖1B。麻醉后，將大鼠仰臥固定在自制鼠板上，剔除頸部正中皮毛，聚維酮碘消毒，剪開約3cm長切口，暴露頸總動脈(CCA)，逐步剝離迷走神經及其周圍小神經血管，剝離頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，見圖1C。備線結扎CCA近心端和ECA近分叉口處，同時在ICA近分叉口處采用動脈夾夾閉，并在 CCA 分叉口處上方5mm 左右備線，打活結，用眼科剪在CCA上剪一45°斜向下切口，將線栓插入切口并將備線系緊，程度為切口處不出血為宜。松開動脈夾，緩慢、柔和地朝向 ICA 插入制備線栓，見圖1D。在此過程中，應防止由于手法不當導致血管痙攣引起插入線栓困難，同時切勿牽拉過猛引起血管痙攣，避開翼腭動脈，若感覺遇到阻力無法插入線栓，則將線栓向外提拉，換方向繼續插入，至標記1.8 cm處且接近 CCA 近分叉處時，停止，備線，結扎CCA，見圖1E。剪斷剩余線頭，頸部傷口處加少量慶大霉素以防感染，縫合切口后聚維酮碘消毒，見圖1F。將大鼠放入25 ℃恒溫保溫箱中，直至大鼠完全清醒。清醒后的大鼠單籠飼養，保持籠內干燥，并保證大鼠能夠自由攝取食物和飲用水，見圖1G。

A:誘導麻醉；B:維持麻醉；C:暴露ECA和ICA；D:插入線栓；E:插入線栓后；F:縫合切口后；G:清醒后大鼠。

1.2.3指標評價

1.2.3.1TTC染色 建立模型24 h后，隨機挑選符合神經功能5分制評分法(4分：意識低下甚至昏睡，不能行走；3分：向病灶對側傾倒；2分：向病灶對側轉圈；1分：病灶對側前肢不能伸展；0分：無神經功能缺失癥狀)[5]成功標準的3只大鼠進行形態學檢測(TTC染色)。

1.2.3.2存活率 存活率=2、7 d內存活大鼠/制備成功大鼠模型數量×100%。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行統計學數據分析。存活率和成功率屬于計數資料，采用率或構成比表示。

2 結 果

2.1成功率 本實驗30只大鼠中，符合神經功能5分制評分法標準即成功建模的大鼠28只，成功率為93.33%，形態學檢測見圖2。

白色區為MCA供血區。

2.2存活率 模型制備后2、7d的存活率分別為100.00%(28/28)和82.14%(23/28)。

3 討 論

3.1線栓法制備大鼠MCAO模型方法 線栓法制備的大鼠MCAO模型與人類缺血性腦卒中模型發病機制相似度高，因此線栓法在此類研究中最常見，應用最廣泛。該模型以其不開顱、易操作、損傷小、缺血效果肯定、重復性好、可準確控制缺血及再灌注時間、大腦中動脈閉塞及再灌注效果好，以及對大鼠生理指標影響小等優點受到眾多學者的高度認可[5-7]。

目前，評價模型制備是否成功及腦梗死測定的參考僅依據神經癥狀評分和TTC染色，前者不能避免主觀評價，后者無法及時評價，影響實驗研究的準確性。隨著多數研究者對線栓法的不斷改進和完善，提高了模型的成功率。改善的方面包括線栓制備、切口位置、是否結扎翼腭動脈、線栓插入的方法、線栓插入深度、造模后護理等[8-9]。

3.2麻醉方法對MCAO的影響 本實驗中采用異氟烷對大鼠進行麻醉制備模型。通過閱讀文獻發現，動物實驗中，水合氯醛和異氟烷均是常用的麻醉劑[10-11]。但研究顯示，水合氯醛由于劑量及對呼吸道腺體的作用等，容易導致手術過程中、術后出現較多問題，如呼吸道阻塞、蘇醒時間延長等，會對實驗過程和結果產生影響[10，12]。由于制備模型時間長，麻醉劑量不足會導致大鼠手術中掙扎，影響手術；而再補加麻醉藥物時，由于麻醉藥物劑量不能確定，可能麻醉過量，造成呼吸抑制、大鼠死亡或清醒推遲影響神經功能癥狀評分；麻醉藥物劑量過多，可能會導致大鼠術后出現腸梗阻、腹膜炎等多種不良反應，造成模型成功率降低，增加實驗成本。

與水合氯醛相比，異氟烷屬于吸入性麻醉劑，麻醉濃度和深度可控性較強，而且術后大鼠清醒時間縮短，更加方便安全。因此，作為動物實驗麻醉藥物的選擇，異氟烷效果更優，可以穩定大鼠血氧分壓、心率等，同時對于腦缺血再灌注、心血管系統和神經系統具有一定的保護作用[11,13]。本實驗中，大鼠模型成功率為93.33%；且大鼠模型制備后2、7 d內，存活率分別為100.00%和82.14%，說明異氟烷作為麻醉劑對于模型制備的成功率和存活率作用較大。

3.3頸部神經、血管分離中的注意事項 本實驗中，麻醉后分離大鼠頸部神經、血管時，應注意在兩側的鼓泡腺體之間進行，對于頸前肌群的充分暴露十分必要，且不會損傷腺體。首先充分暴露CCA，其次，逐步剝離迷走神經，剝離、暴露ECA和ICA。需要注意的是，在頸部血管分離過程中，應盡量保證剝離干凈血管外膜，避免牽拉損傷ICA和ECA分叉處的交感神經節和迷走神經，因為牽拉損傷可能造成大鼠死亡或呼吸抑制，從而降低模型成功率和存活率。

3.4線拴插入過程中的注意事項 線栓進入ECA后，多數情況下能順利插入至MCA，但有時插入時則會遇到明顯阻力，難以進入，這時一定不能繼續盲目反復插入，正確的做法是抽出較多線栓，調整線栓角度，重新進入。如果仍不能進入應及時更換新的線栓。插入線栓時很難進入是因為血管穿入顱骨時有一個狹窄或角度，這時若盲目插入，極易損傷血管。線栓不能在血管內反復用力提插，否則會引起線栓前端變形，導致插入時損傷血管或血管痙攣，造成顱內出血或線栓插入困難情況的發生，影響模型質量，延長造模時間。如出現此類情況，應將線栓稍向外退出，調整插入方向，再進行插入，若仍然出現插入困難，應及時更換線栓。

線栓插入深度也應注意。線栓插入淺會造成制備模型失敗，線栓插入深易引起蛛網膜下腔出血；若線栓插入時大鼠出現顫動，說明線栓誤插入至翼腭動脈。線栓插入切勿過深，過深易損傷血管造成蛛網膜下腔出血，神經功能癥狀過重且造成大鼠生存周期短。本實驗前期大量制備模型時發現，線栓插入深度18 cm時，大鼠術后神經功能評分穩定且成模率高，張成英等[14]報道，線栓插入深度為17～19 cm。因此，本實驗線栓插入深度為18 cm。

3.5術后感染的預防 術前對手術器械、大鼠手術切口都要進行嚴格的消毒，術后縫合前在傷口周圍噴少量慶大霉素以防感染，縫合后傷口部位用聚維酮碘消毒，可降低模型死亡率，有助實驗順利進行。

3.6術后護理和營養支持 在室溫條件下(25 ℃)進行手術，對大鼠進行白熾燈照射以維持大鼠正常體溫。術后將大鼠放入25 ℃恒溫透明保溫箱中，直至大鼠完全清醒。前期實驗發現，術后部分大鼠出現進食、便溏、消瘦等癥狀[8-11]。因此本實驗術后采用1%的蔗糖水3～5 mL添加至飲用水中，給予大鼠營養支持。

綜上所述，在動物實驗研究中，應根據研究方向和觀察指標選擇不同的造模方法，這是進行動物實驗的首要條件。同時，不同大鼠MCAO模型制備方法各有利弊，適用范圍不盡相同。作者認為，成功的大鼠MCAO模型應至少滿足以下條件：(1)成功率、存活率高；(2)梗死灶位置固定，梗死范圍和程度可控；(3)與人類缺血性腦卒中生理病理發生、發展變化過程一致，以此有利于對各種繼發性損害及誘發因素的研究；(4)重復性高，穩定性和可操作性強，成本低。然而，目前尚缺乏高質量的MCAO模型，仍存在許多不可控因素，因此，科研人員仍需要在實踐中不斷探索，最大限度地復制與人類局灶性腦缺血發病過程近似的動物模型及控制相關影響因素，建立更加科學合理的模型制備方法，規范化MCAO模型的制備，這將更有利于深入研究缺血性腦卒中的發生和發展機制。