復(fù)方丹參注射液對(duì)子癇前期大鼠凝血功能和腎功能的影響研究*

彭瓊琳，黃 敏

(鄂鋼醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 鄂州 436000)

子癇前期(PE)是指孕前血壓正常，但孕周20周后開(kāi)始出現(xiàn)以尿蛋白和血壓升高并伴發(fā)凝血功能障礙的一種婦產(chǎn)科常見(jiàn)疾病，如治療不及時(shí)，則最終發(fā)展為重度PE或子癇[1]。PE與孕婦多胎、既往病史或年齡等高危因素或免疫因素有關(guān)，造成孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡，僅次于產(chǎn)后出血和羊水栓塞風(fēng)險(xiǎn)[2]。中西醫(yī)結(jié)合治療可改善PE患者血壓狀況、提高自然分娩率和總有效率并降低剖宮產(chǎn)率、產(chǎn)鉗助產(chǎn)率，在新生兒合并癥及妊娠結(jié)局等方面均優(yōu)于單純西醫(yī)治療[3]。復(fù)方丹參注射液可顯著降低PE發(fā)病率，促進(jìn)胎兒的預(yù)后并減少不良妊娠結(jié)局[4]。本研究在建立SD大鼠PE模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)經(jīng)尾靜脈注射給藥的方法觀察復(fù)方丹參注射液對(duì)PE大鼠凝血功能和腎功能的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠60只(雌鼠40只，雄鼠20只)，10～11周齡，體重(262.50±10.99)g，由武漢金塘鑫養(yǎng)殖科技有限公司提供，許可證：[SCXK(鄂) 2018-0015]。每晚18:30按雌雄2∶1比例合籠，過(guò)夜后于清晨 8：00取雌鼠，以顯微鏡下觀察陰道分泌物涂片見(jiàn)到精子者為受孕大鼠，記受孕 0 d。將受孕的40只雌鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、低分子肝素鈉(C組)和復(fù)方丹參注射液組(D組)并分組飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)大鼠自由飲水、喂養(yǎng)普通飼料。動(dòng)物房溫度24～25 ℃，相對(duì)濕度50%～75%，勤換墊料，保證大鼠福利。

1.1.2試劑與儀器 復(fù)方丹參注射液(廣東新峰藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：Z44021269)，低分子肝素鈉(吉林華康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：0190210)，亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME，上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào)：A0015)，戊巴比妥鈉(上海第一化工廠，批號(hào)：0891124)，大鼠纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司，批號(hào)：ZY-FG-R198a)，大鼠D-二聚體(D-D)檢測(cè)試劑盒(基蛋生物科技股份有限公司，批號(hào)：Q0912)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)，MedLab-MS60X型大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)試系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛(STBM)培育 先配制100 mL含1%青-鏈霉素的NaCl溶液，取提前交配成功的妊娠孕鼠5只(第18天)，用3%戊巴比妥鈉麻醉后固定、剖宮并迅速摘取孕鼠胎盤(pán)。使用PBS沖洗干凈后剪成約1 mm×1 mm×1 mm，然后將組織塊放入上述溶液中 4 ℃振蕩過(guò)夜收集 STBM富集，再用PBS緩沖液將STBM稀釋成0.14 mg/mL的溶液。

1.2.2PE模型建立及治療 待大鼠妊娠第5天時(shí)，除A組外，其他組均經(jīng)尾靜脈注射2 mL稀釋后的STBM(每天1次，連續(xù)注射10 d)；再于第13天按125 mg/kg劑量從皮下注射L-NAME，每天1次，連續(xù)注射7 d[5]。本實(shí)驗(yàn)采用MedLab-MS60X型大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)試系統(tǒng)測(cè)量血壓并以孕鼠血壓大于或等于18 kPa和尿蛋白定量(UP)≥4.0 mg為成模標(biāo)志[6]。治療均按每天1次、經(jīng)尾靜脈注射給藥，四組治療7 d。其中A、B組注射生理鹽水(1 mL/d)對(duì)照；C組注射低分子肝素鈉，劑量為10 mg/(kg·d)；D組按10 mg/(kg·d)注射復(fù)方丹參注射液。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1腎功能 將孤養(yǎng)大鼠置于標(biāo)準(zhǔn)代謝籠內(nèi)中，收集24 h 尿量(UV)，采用乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定UP，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血尿素氮(BUN)和血肌酐 (SCr)。

1.2.3.2凝血功能 (1)采用斷尾法判定出血時(shí)間(BT)，玻片法判定凝血時(shí)間(CT)。(2)內(nèi)/外源性凝血因子 Xa和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)采用凝血因子生成實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)時(shí)斷尾取全血1 mL，再準(zhǔn)確提取全血中105個(gè)細(xì)胞，分別加入含130 nmol/L因子X(jué)、l nmol/L因子IXa、5 nmol/L因子Ⅷ、 0.2 nmol/L凝血酶(Ⅱ a)和5 mmol/L CaCl2緩沖液，孵育10 min后用7 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)終止；加1 mmoL顯色底物，用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)處內(nèi)/外源性凝血因子 Xa和APTT[7]。(3)干式免疫熒光法檢測(cè)D-D和FIB，檢測(cè)時(shí)按試劑說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.3.3仔鼠發(fā)育情況 治療7 d后，用3%戊巴比妥鈉麻醉后固定、剖宮并迅速摘取孕鼠胎盤(pán)。清點(diǎn)死胎數(shù)和存活仔鼠數(shù)量并計(jì)算死胎率[死胎率=死胎數(shù)/(存活仔鼠數(shù)量+死胎數(shù))]，測(cè)量仔鼠身長(zhǎng)、體重并稱胎盤(pán)濕重。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎功能變化比較 與A組比較，B、C組24 h UV降低，UP、BUN和SCr水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組上述指標(biāo)與B組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與B、C組比較，D組24 h UV明顯升高，UP、BUN和SCr則均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腎功能變化比較

2.2各組大鼠凝血功能變化比較 與A組比較，B組APTT、BT和CT均縮短，內(nèi)/外源性凝血因子X(jué)a、D-D、FIB水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組比較，C組凝血指標(biāo)中APTT、BT和CT均延長(zhǎng)，內(nèi)/外源性凝血因子X(jué)a、D-D、FIB水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組與C組相似，但D組凝血指標(biāo)中的APTT、BT、CT、內(nèi)/外源性凝血因子X(jué)a的作用沒(méi)有C組強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C、D組D-D、FIB水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠凝血功能變化比較

2.3各組大鼠仔鼠發(fā)育情況比較 B組存活仔鼠數(shù)量低于A組，死胎率較A組高，仔鼠身長(zhǎng)、體重和胎盤(pán)濕低于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C、D組存活仔鼠均較B組增多，死胎率均較B組降低，仔鼠身長(zhǎng)、體重和胎盤(pán)濕重均較B組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C、D組上述仔鼠情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠仔鼠發(fā)育情況比較

3 討 論

PE患者除妊娠合并高血壓、水腫外，還表現(xiàn)為腎功能損傷和凝血功能障礙，表現(xiàn)為UP、BUN和SCr升高，24 h UV減少，腎損傷逐步加重[8]。其中凝血功能紊亂患者若不及時(shí)控制，可能導(dǎo)致死胎或流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局，嚴(yán)重者還會(huì)引起彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)并最終造成多器官功能衰竭[9]。由此可見(jiàn)，促凝血-抗凝因子失衡是導(dǎo)致PE病理進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)，在治療中糾正血液高凝狀態(tài)對(duì)PE及針對(duì)其并發(fā)癥的預(yù)防和治療尤其重要[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參注射液組(D組)的腎功能改善明顯，D組UP、BUN和SCr均較模型組(B組)明顯降低，24 h UV明顯較B組增多，提示復(fù)方丹參注射液可改善PE模型大鼠腎功能。另外，D組促凝血-抗凝因子失衡現(xiàn)象也基本得以糾正，D組大鼠APTT、BT、CT均較B組延長(zhǎng)，內(nèi)/外源性凝血因子X(jué)a、D-D和FIB均較B組降低，提示復(fù)方丹參注射液可糾正PE模型大鼠促凝血-抗凝因子失衡現(xiàn)象，即糾正凝血功能紊亂現(xiàn)象。復(fù)方丹參注射液主要成分為丹參素和原兒茶醛[11]。丹參素具有擴(kuò)張血管并改善循環(huán)，從而增加腎血液流量，達(dá)到利尿和腎功能恢復(fù)的功效[12]。其活血化瘀功效可產(chǎn)生抗血小板凝集作用，通過(guò)改善血液流變學(xué)特性而影響凝血機(jī)制[13]。還可控制血壓、改善腎功能、糾正凝血功能紊亂[14]。使用復(fù)方丹參注射液在輔助治療PE時(shí)可延長(zhǎng)孕周，促進(jìn)新生兒發(fā)育，有利于良好的妊娠結(jié)局[15]。在本研究中，D組存活仔鼠數(shù)量較B組增多，死胎率降低，仔鼠身長(zhǎng)、體重和胎盤(pán)濕重均高于B組，佐證了復(fù)方丹參注射液有利于良好的妊娠結(jié)局。

臨床上如何有效逆轉(zhuǎn)孕婦高凝狀態(tài)及預(yù)防并發(fā)癥方面，主要應(yīng)用藥物進(jìn)行抗凝、降壓來(lái)改善組織灌注，從而在微觀層面抑制PE疾病進(jìn)展以達(dá)到治療的目的[16]。低分子肝素鈉具有抗Xa活性，通過(guò)促進(jìn)抗凝血酶Ⅲ結(jié)合凝血酶抑制凝血酶和多種凝血因子活動(dòng)，降低體內(nèi)、體外血栓和動(dòng)靜脈血栓的形成而發(fā)揮較強(qiáng)的抗凝作用[17]。本研究觀察到低分子肝素鈉(C組)對(duì)腎功能幾乎無(wú)作用，但復(fù)方丹參注射液對(duì)卻能明顯改善腎功能，這也提示后者在改善腎功能方面優(yōu)于前者。另外，低分子肝素鈉對(duì)凝血-纖溶系統(tǒng)影響較復(fù)方丹參注射液更明顯，如對(duì)內(nèi)/外源性凝血因子X(jué)a的抑制作用強(qiáng)烈。低分子肝素鈉雖不影響血小板聚集和FIB與血小板的結(jié)合，但妊娠初3個(gè)月婦女或產(chǎn)后婦女使用本品可能增加出血的危險(xiǎn)，故須慎用。復(fù)方丹參注射液作用較低分子肝素鈉弱，但不影響其對(duì)PE凝血-纖溶系統(tǒng)的影響，也可達(dá)到糾正凝血功能紊亂的作用。本研究中，復(fù)方丹參注射液對(duì)D-D和FIB的作用尤為明顯，作用與低分子肝素鈉持平。

綜上所述，復(fù)方丹參注射液具有改善PE模型大鼠凝血功能和腎功能作用。其通過(guò)解除全身血管痙攣、增加組織器官、特別血流量，恢復(fù)腎小球基底膜通透性，從而增加24 h UV、降低UP，增強(qiáng)腎臟清除BUN和SCr的能力，在糾正PE模型大鼠促凝血-抗凝因子失衡和腎功能損傷方面起到重要作用。