崇左市邊境山羊口蹄疫、小反芻獸疫疫苗免疫效果評估

龍鳳 李劍鋒 李暉仁 何杰勇 秦桂清 黃麗非 張色萍 李桂花 農潔田

（1.崇左市動物疫病預防控制中心，廣西 崇左532200；2.崇左市畜牧站，廣西 崇左532200；3.崇左市江州區動物疫病預防控制中心，廣西 崇左532200）

口蹄疫（Foot-and-Mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度傳染性的疫病，該病傳播速度快，距離遠。易感動物包括豬、牛、羊等偶蹄動物。臨床上以口鼻、乳房、蹄冠和趾間的皮膚黏膜出現水泡和爛斑為特征。口蹄疫目前已發現七個血清型，分別為南非1、2、3型，亞洲Ⅰ型和A、O、C型，我國主要流行的血清型為O型、A型和亞洲Ⅰ型。口蹄疫不同血清型之間無交叉保護，防控難度大，是危害我國畜牧業健康發展的一類重大動物疫病[1，2]。

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants,PPR）俗稱羊瘟，是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性、烈性傳染病，主要感染小反芻動物，以山羊和綿羊最為易感，臨床上主要表現為發熱、口炎、腹瀉、肺炎等，發病率和致死率可達100%。該病于2007年7月首次傳入我國西藏，2013年11月起再次傳入新疆，隨后甘肅、內蒙、寧夏等地相繼暴發疫情，并且在數月內蔓延至全國大部分省份[3，4]。

當前，這兩種疫病暫無有效治療措施，疫苗免疫是預防這兩種疫病發生的最重要手段。近年來崇左市大力發展羊養殖業，始終將FMD和PPR防控作為防疫工作的重點，通過強制免疫FMD滅活疫苗和PPR弱毒疫苗等手段達到對這兩種疫病防控。

為了合理使用口蹄疫及小反芻獸疫疫苗，掌握兩種疫苗不同免疫方法對免疫抗體的效價和消長規律的影響，降低免疫成本，提高工作效率，本研究對崇左市規模化羊場口蹄疫O-A型二價滅活苗和小反芻獸疫弱毒苗（Clone 9株）免疫后羊群進行抗體水平監測，通過比較兩種疫苗以不同的方法免疫后抗體變化規律和免疫持續期，綜合評估這兩種疫苗在邊境山區羊場的臨床免疫效果，為進一步優化適合邊境山區羊場的疫苗免疫程序提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 在崇左市選取2個飼養管理條件相當的規模羊場，每個羊場選3月齡肉羊45只，試驗羊品種、大小相近，臨床檢查健康，從未接種過口蹄疫疫苗和小反芻獸疫疫苗。

1.1.2 疫苗種類 口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗（O/MYA98/BY/2010株+Re-A/WH/09株），由中農威特生物科技股份有限公司生產；小反芻獸疫活疫苗（Clone9株），由西藏自治區獸醫生物藥品制造廠生產。

1.1.3 檢測試劑 口蹄疫病毒O型抗體ELISA檢測試劑盒（JNT金諾診斷，批號：20190405）和A型抗體ELISA檢測試劑盒（JNT金諾診斷，批號：20190812）均購自北京金諾百泰生物技術有限公司；小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒（青島立見，批號:02171907），購自青島立見診斷技術發展中心。

1.1.4 儀器設備 酶標儀（RT-6100），購自深圳雷杜生命科學股份有限公司；移液器，購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組與免疫及采血時間設定 將兩個羊場90只試驗羊隨機分為5個組，其中A-D組為試驗組，每組20只；E組為對照組，10只。A組同時分點免疫口蹄疫O-A疫苗、小反芻獸疫疫苗；B組先免疫口蹄疫O-A疫苗，7d后再免疫小反芻獸疫疫苗；C組先免疫小反芻獸疫疫苗，7d后再免疫免疫口蹄疫O-A疫苗；D組同時分點免疫口蹄疫O-A疫苗、小反芻獸疫疫苗，28d后再進行二免。

口蹄疫O-A疫苗每只羊頸部肌肉注射2mL，小反芻獸疫疫苗每只羊頸部皮下注射1mL。試驗分組及各組免疫情況見表1。所有羊只分別于免疫后0d、7d、14d、28d、42d、56d、70d、120d、150d頸靜脈采血備檢。

表1 試驗分組及疫苗免疫情況

1.2.2 血清樣品采集、處理方法 按試驗設計使用5mL采血貯血器采血，每管采集3mL左右，離心后分離血清，分裝并做好標記。于-20℃保存待檢。

1.2.3 檢測方法 口蹄疫O型、A型抗體采用固相阻斷ELISA方法，檢測FMDV結構蛋白抗體，按照試劑盒說明書進行；小反芻獸疫抗體檢測按照小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.2.4 判定標準 口蹄疫O型、A型抗體：試驗成立條件 陰性對照OD450nm平均值大于0.7；陽性對照S/N平均值＜0.3；S/N=樣品OD值/（NC OD均值），NC OD均值=NC1+NC2。判定：S≤0.5·N判為陽性，S＞0.5·N判為陰性。

小反芻獸疫抗體：陰性血清平均OD值，即OD·NC；陽性血清平均OD值即ODPC，酶標抗體平均OD值即ODcm；樣品的OD值即ODS，計算陰性對照、陽性對照、樣品的阻斷率PB。

PB=100-100*OD/ODcm。試驗成立條件：PBPC＞60，PBNC＜40，試驗結果有效。判定：PBS＞50，結果為陽性；PBs≤50，結果為陰性。

2 結果與分析

2.1 口蹄疫O型免疫抗體檢測結果

從表2可以看出，試驗羊免疫前口蹄疫O型抗體均為陰性。A-C組山羊分別在各自免疫后第7d開始產生抗體，28d時抗體水平最高，分別達到80%、85%、85%，超過70%陽性率的國家標準。口蹄疫O型免疫抗體從免疫后42d開始下降，70d時接近國家70%陽性率標準，120d時遠遠低于70%的標準。同時免疫和兩種疫苗分先后免疫的3組不同免疫方式，對口蹄疫O型抗體陽性率影響差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同免疫分組中口蹄疫O型抗體檢測結果 單位：%

對比A組和D組檢測結果可以看出，只進行一次免疫的A組抗體陽性率在28d時最高，之后開始下降，第70d時下降到70.59%，150d時下降到26.67%；而D組在一免后28d加強免疫一次，口蹄疫O型抗體陽性率在二免后14d達到100%，并且到150d時還有73.33%的抗體陽性率，說明二次免疫增強了免疫效果。

2.2 口蹄疫A型免疫抗體檢測結果

從表3來看，試驗羊免疫前口蹄疫A型抗體均為陰性。分析A-C組檢測結果可以看出，山羊在各自免疫后第7d開始產生抗體，28d時抗體水平最高，均達到80%，C組在7d時免疫口蹄疫疫苗，42d時抗體水平最高達到80%，到70d時A-C組的口蹄疫A型抗體均已低于70%陽性率標準。3組不同免疫方式下對口蹄疫A型抗體陽性率影響差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同免疫分組中口蹄疫A型抗體檢測結果 單位：%

對比A組和D組檢測結果可以看出，只進行一次免疫的1組抗體陽性率在28d時最高，之后開始下降，第70d時下降到64.71%，150d時下降到20%；而D組在一免后28d加強免疫一次，口蹄疫A型抗體陽性率在二免后14d達到100%，并且到150d時還有73.33%的抗體陽性率，說明二次免疫增強了免疫效果。

2.3 小反芻獸疫免疫抗體檢測結果

從表4可以看出，試驗羊免疫前小反芻獸疫抗體均為陰性。A、C、D組在0d時免疫小反芻獸疫疫苗，7d時抗體陽性率均達90%以上，B組在7d時免疫小反芻獸疫苗，14d時抗體陽性率達95%。所有組在免疫后第7d均產生很高的抗體陽性率，并且持續到150d時仍有90%以上的陽性率。綜合分析4個試驗組檢測結果發現，聯合其他疫苗免疫、單獨免疫、增加二次免抗，小反芻獸疫抗體陽性率差異不顯著（P＞0.05）。

表4 不同免疫分組中小反芻獸疫抗體檢測結果 單位：%

3 討論與小結

崇左市地處西南邊陲，是我國最大的甘蔗種植、蔗糖生產基地，素有“中國糖都”之稱。全市年種植甘蔗400多萬畝，產生大量的甘蔗秸稈，為草食動物提供豐富的青貯飼料，非常適合草食動物產業的發展。近年來，該市牛羊養殖業得到了迅猛發展，中小規模羊場在崇左山區遍地開花，2017年出欄山羊近10萬只。由于口蹄疫、小反芻獸疫等危害羊群發展的重大動物疫病在我國時有發生并呈一定的流行態勢[4，5]，國外疫情更為復雜，疫病防控形式嚴峻。崇左市有4個縣（市）與越南接壤，邊境線長達533km，加強邊境動物免疫帶建設，建立有效免疫屏障，是防止口蹄疫、小反芻獸疫等疫病傳入與流行的主要措施之一。

疫苗的免疫效果受多方因素的影響，其中保存方式、免疫劑量、免疫方法、免疫程序、外界應激、自身健康狀態、養殖管理條件等等，都會影響免疫效果[6]。多種疫苗同時分點免疫，能降低免疫成本，減少動物應激，但若疫苗組合不當，可能會導致兩種疫苗之間產生免疫應答干擾現象，降低免疫效果，并且動物機體會因同時承受多種抗原的刺激導致抵抗力下降而引發疾病[7]。在該次試驗中，所有的試驗組山羊沒有出現明顯的免疫副反應，采食、增重、健康狀態等與對照組無明顯差異，說明試驗選擇的兩種疫苗都具有較高的安全性。從各試驗組來看，不同的免疫方法所檢測的口蹄疫、小反芻獸疫抗體陽性率之間差異不顯著，說明這兩種疫苗可以同時分點注射，這樣可以降低多次注射疫苗帶來的應激反應，提高工作效率，降低勞動強度。

該次試驗對口蹄疫疫苗采取頸部肌肉注射2mL的方式進行免疫，山羊O型、A型口蹄疫免疫抗體陽性率雖然都超過了國家規定的標準，但是只進行一次免疫，其抗體水平都不是很高，免疫持續時間也不長，可能是由于口蹄疫疫苗為滅活苗，對動物機體刺激有局限性，免疫效果有待提高。試驗發現免疫口蹄疫O-A二價滅活苗，雖然O型、A型抗體消長規律相近，但A型抗體陽性率比O型抗體陽性率略低，可能與疫苗中兩個亞型毒株的濃度有關，也可能與動物機體反應有關。該次試驗證明對山羊進行口蹄疫二次免疫，可明顯提升抗體陽性率和效價持續時間。這與郝玉清[8]、鄭秀紅[9]、陽廷朗[10]等的研究結果相符合。

該次試驗對小反芻獸疫疫苗采取頸部皮下注射1mL的方式進行，4個免疫試驗組均在免疫后7d開始產生抗體，14d后抗體陽性率上升到100%，抗體水平達到峰值，免疫抗體陽性率差異不顯著，表明疫苗具有良好的免疫原性和較長的免疫持續期。在試驗過程中，由于經歷較長時間，部分試驗羊被場主賣出，部分羊標識不清或丟失，無法連續跟蹤，導致有些血清樣品采集缺乏連貫性。同時由于條件限制未對小反芻獸疫免疫羊群進行免疫持續期監測，但從抗體水平及陽性率考慮，其持續期應不低于1年[10，11]，每年加強免疫1次即可。

綜上所述，口蹄疫O型、A型二價疫苗與小反芻獸疫疫苗可以同時分點注射，所產生的抗體水平較高，兩種疫苗不產生干擾。但口蹄疫疫苗免疫有效期短，建議28d后加強免疫1次。本試驗為兩種疫苗的合理使用提供了依據，可大規模推廣應用。