高糖環境下BCA-1通過血管平滑肌細胞對間充質干細胞增殖和凋亡的影響

李永濤，沈雷，張善強，姜楊，孫石柱

齊齊哈爾醫學院基礎醫學院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

糖尿病患者全球約4.51億人[1]，我國糖尿病患發病率保守估計約為11%[2]。控制糖尿病及其并發癥卻不理想。間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSC）作為細胞治療的首選細胞被用于多種疾病的治療[3-5]。提高MSC歸巢效率將促進MSC的再生修復能力。B淋巴細胞化學引誘物-1（b-lymphocyte chemical attractants-1，BCA-1）又稱趨化因子13（CXC motif chemokine ligand 13,CXCL-13），不僅作為判斷肝癌預后的良好指標[6]，還可以激活CXCR5/ERK信號通路而加速乳腺癌細胞轉移[7]。CXCL-13可以降低癌細胞免疫原性，在腫瘤免疫逃避中發揮作用[8]。此外發現MSC分泌的CXCL-13可促進骨髓瘤細胞侵襲，增加耐藥性[9]。也有研究發現，BCA-1結合于MSC的CXCR5受體，誘導MSC成骨分化、成肌腱分化，在肌腱-骨愈合過程中發揮再生修復作用[10-11]。缺氧環境下，BCA-1通過MAPK/NFκB信號通路促進MSC自噬和增殖[12]。因此，BCA-1可能在招募MSC遷移或降低MSC低免疫原性等“干性”作用中發揮著重要作用。

MSC由血管遷移到組織是MSC穿過血管的過程，目前還不清楚BCA-1招募MSC歸巢與血管平滑肌細胞的關系。該研究在細胞高糖模型下，以BCA-1刺激主動脈平滑肌細胞（aortic smooth muscle cells，ASMC）的上清液制備條件培養基，觀察各組ASMC對MSC增殖和凋亡作用及分子機制，為BCA-1誘導MSC歸巢穿越血管壁，治療糖尿病及其并發癥提供研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠主動脈平滑肌細胞（mASMC）、小鼠骨髓間充質干細胞（mBMSC）均購自深圳豪地華拓生物科技有限公司；小鼠BCA-1重組蛋白購自武漢艾美捷科技有限公司；LY294002重組蛋白購自美國Selleck公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）、α-MEM培養基、RPMI-1640培養基均購自美國Hyclone公司；Annexin VFITC/PI細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；CCK-8購自日本Dojindo公司；苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）購自上海碧云天生物技術有限公司；小鼠IL-8、Akt、磷酸化-Akt（Phosphorylation-Akt,p-Akt）蛋白的ELISA試劑盒購自美國R&D公司。兔抗小鼠Caspase-8、兔抗小鼠β-actin和HRP標記羊抗兔IgG購于Abcam公司。美國Molecular Devices公司的Emax酶標儀；美國BD公司的FACSAria II型流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞高糖模型 含30 mmol/L葡萄糖的培養基為細胞高糖培養基，用細胞高糖培養基培養的細胞為高糖細胞模型[13]。

1.2.2 mASMC培養與分組 含10%FBS的RPMI-1640培養基培養mASMC。正常條件下培養的mASMC為正常對照組。高糖環境下培養的mASMC為高糖對照組；以50 ng/mL BCA-1刺激者為高糖BCA-1組；若預先加入10μmol/L LY294002培養60 min，0.01 mmol/L PBS清洗后，再以50 ng/mL BCA-1刺激則為高糖PI3K抑制劑組。

1.2.3 條件培養基1.5×105各組mASMC，在37℃，5%CO2培養12 h后，取上清液；1 000 r/min離心5 min，0.22μm濾器抽濾；與mBMSC培養基按1:5稀釋，即為各組mASMC的條件培養基（Conditioned medium，CM）[13]，用于培養mBMSC。

1.2.4 mBMSC培養與分組 含10%FBS的α-MEM培養基培養mBMSC。正常條件下培養mBMSC為正常對照組：高糖環境下無任何刺激者為高糖對照組。以mASMC的高糖對照組CM、高糖BCA-1組CM和高糖PI3K抑制劑組CM培養的mBMSC，分別為高糖CM組、高糖BCA-1CM組和高糖PI3K抑制劑CM組。

1.2.5 CCK-8實驗 8.0×103mBMSC培養在96孔板，37℃、5%CO2培養12 h；0.01 mmol/L PBS清洗3次，1 min/min。按照mBMSC分組而加入相應的培養基或試劑，繼續培養12 h。各孔加入CCK-8溶液10μL，37℃、5%CO2培養2 h后，Emax酶標儀于450 nm處檢測各組mBMSC吸光度值（Absorbance value，A）。

1.2.6 流式細胞凋亡實驗 2.0×105各組mBMSC細胞重懸于1.25%Annexin V-FITC溶液中，室溫孵育15 min，4℃，10 000 r/min離心5 min后，加入等體積的2%PI溶液，冰上孵育2 min，4℃，10 000 r/min離心5 min后，0.01 mmol/L PBS重懸，FACSAria II流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 West er n bl ot 含1 mmol/L PMSF的細胞裂解液裂解各組5.0×106 mBMSC，4℃，12 000 r/min離心60 min。BCA蛋白濃度測定試劑盒定量。濃縮膠75 V電泳30 min，分離膠110 V電泳45 min；75 V轉膜2 h至硝酸纖維素膜。脫脂奶粉封閉后，加入兔抗小鼠Caspase-8抗體 （1∶550），兔抗小鼠β-actin抗體（1:800），4℃過夜后；加入HRP標記羊抗兔IgG（1∶500），室溫孵育120 min；滴加ECL試劑，Tanon 6 200發光成像工作站顯影。Image-Pro Plus 6.0.1圖像分析軟件檢測各蛋白條帶的相對光密度值 （Optical density value,OD），并計算各蛋白的相對表達量。

1.2.8 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）提取5.0×106各組mASMC上清液，小鼠IL-8蛋白ELISA試劑盒檢測各組mASMC上清液中IL-8蛋白含量。含1 mmol/L PMSF的裂解液裂解各組mASMC，4℃，12 000 r/min離心8 min，提取各組細胞裂解液。小鼠Akt、p-Akt蛋白ELISA試劑盒檢測各組mASMC裂解液中Akt、p-Akt蛋白含量。

1.3 統計方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Q檢驗；計數資料用[n(%)]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組條件培養基對mBMSC增殖的影響

正常對照組、高糖對照組、高糖CM組、高糖BCA-1CM組、高糖PI3K抑制劑CM組mBMSC的A值分別為（1.47±0.20）、（0.62±0.39）、（0.85±0.22）、（1.31±0.15）、（0.53±0.34），差異有統計學意義（F=80.33，P＜0.01）。高糖對照組A值是正常對照組的0.42倍，差異有統計學意義（P＜0.01）；高糖對照CM組A值是高糖對照組的1.37倍，差異有統計學意義（P＜0.05）；高糖BCA-1CM組A值是高糖對照CM組1.54倍，差異有統計學意義（P＜0.01）；高糖PI3K抑制劑CM組A值是高糖BCA-1CM組的0.40倍，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。結果提示高糖環境下，BCA-1刺激的mASMC條件培養基能促進mBMSC增殖。

圖1 CCK-8實驗檢測各組mBMSC增殖

2.2 各組條件培養基對mBMSC凋亡率的影響

各組mBMSC的細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。高糖對照組mBMSC細胞凋亡率是正常對照組的2.02倍，差異有統計學意義（P＜0.01）；高糖BCA-1CM組mBMSC細胞凋亡率是高糖CM組的62.2%，差異有統計學意義（P＜0.01）；高糖PI3K抑制劑CM組mBMSC凋亡率是高糖BCA-1CM組的1.37倍，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 流式細胞術分析各組mBMSC凋亡

2.3 各組條件培養基對mBMSC的Caspase-8蛋白表達的影響

為了進一步驗證各組條件培養基對mBMSC凋亡的影響，Western blot檢測各組mBMSC的Caspase-8蛋白表達。正常對照組、高糖對照組、高糖CM組、高糖BCA-1CM組、高糖PI3K抑制劑CM組的Caspase-8蛋白相對表達量分別為（0.52±0.03）、（0.75±0.08）、（0.70±0.06）、（0.42±0.04）、（1.10±0.01），差異有統計學意義（F=488.00，P＜0.01）。高糖對照組Caspase-8蛋白是正常對照組的1.44倍，差異有統計學意義（P＜0.01）；高糖CM組Caspase-8蛋白是高糖對照組的0.93倍，差異有統計學意義（P＜0.05）；高糖BCA-1CM組Caspase-8蛋白是高糖CM組0.60倍，差異有統計學意義（P＜0.01）；高糖PI3K抑制劑CM組Caspase-8蛋白是高糖BCA-1CM組2.38倍，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3。兩種細胞凋亡實驗結果均提示高糖環境下，BCA-1通過激活mASMC內PI3K信號通路，受BCA-1刺激的mASMC條件培養基能降低mBMSC凋亡。

圖3 Western blot法檢測各組mBMSC的Caspase-8蛋白表達

2.4 BCA-1對mASMC的Akt、p-Akt、IL-8蛋白表達的影響

ELISA檢測各組mASMC裂解液中Akt、p-Akt蛋白含量。高糖對照組的Akt、p-Akt蛋白量分別是正常對照組的1.27倍、1.06倍，差異有統計學意義（P＜0.001）；高糖BCA-1組的Akt、p-Akt蛋白含量分別是高糖對照組的1.54倍、1.40倍，差異有統計學意義（P＜0.001）；高糖PI3K抑制劑組的Akt、p-Akt蛋白含量分別是高糖BCA-1組的0.68倍、0.79倍，差異有統計學意義（P＜0.001）。ELISA檢測各組mASMC上清液中IL-8含量發現，高糖對照組的IL-8蛋白量是正常對照組的1.50倍，差異有統計學意義（P＜0.001）；高糖BCA-1組的IL-8蛋白含量是高糖對照組的1.92倍，差異有統計學意義（P＜0.001）；高糖PI3K抑制劑組的IL-8蛋白含量是高糖BCA-1組的0.77倍，差異有統計學意義（P＜0.001），見表1。這說明BCA-1激活mASMC內Akt通路，促進mASMC表達IL-8蛋白，PI3K抑制劑能夠阻斷這一過程。

表1 BCA-1對mASMC的Akt、p-Akt蛋白表達的影響[（±s），μg/mL]

表1 BCA-1對mASMC的Akt、p-Akt蛋白表達的影響[（±s），μg/mL]

注:a P＜0.001，與正常對照組比較；b P＜0.001，與高糖對照組比較；c P＜0.001，與高糖BCA-1組比較

指標正常對照組（n=16）高糖對照組（n=16）高糖BCA-1組（n=16）高糖PI3K抑制劑組（n=16）F值 P值Akt p-Akt IL-8 6.03±0.14 5.16±0.09 2.38±0.34（7.71±0.29）a（5.48±0.15）a（3.57±0.28）a（11.85±0.18）b（7.69±0.13）b（6.84±0.21）b（8.16±0.24）c（6.10±0.12)c(5.33±0.67)c 1987.68 1308.22 357.74<0.001<0.001<0.001

3 討論

糖尿病及其相關并發癥造成患者生活質量的下降[14]。胰腺及胰島細胞的移植雖可解決上述弊端，但由于供體來源短缺，易出現免疫排斥反應，致使移植手術難以在臨床廣泛推廣[15]。體內分布廣泛的MSC具有容易提取、易于培養、多分化性、低免疫原性等特點，為糖尿病及其并發癥的治療帶來希望。趨化因子是一族小的多肽，主要作用為活化細胞，促進細胞運動[16]。研究發現MSC可表達CCR1、CCR7、CCR9、CXCR4、CXCR5等多種趨化因子配體[8]，趨化因子可促進MSC等細胞歸巢并在組織中集聚[17]。BCA-1（CXC13）可與MSC表達的CXCR5配體結合，促進人骨髓MSC的增殖和自噬[12]，并能夠提高MSC成骨分化的能力[10]，BCA-1提高了大鼠損傷肌腱張力負荷水平，促進小鼠C3HIOT1/2間充質細胞系ERK1/2、JNK和p38蛋白的表達，提高C3HIOT1/2細胞成骨能力[10]。但是BCA-1在高糖環境下對MSC增殖或凋亡的影響卻鮮見報道。

該研究探討高糖環境下，BCA-1處理的ASMC對MSC增殖和凋亡的影響。30 mmol/L葡萄糖建立的細胞高糖模型相當于血糖濃度540 mg/dl，Shen L等[13]也據此建立細胞高糖模型，是比較認可的細胞高糖模型。高糖對照組mBMSC的A值與正常對照組相比，出現明顯降低，其原因可能與高糖環境導致細胞內活性氧、氧自由基等物質增多有關。張磊等[18]研究HK-2正常人近端腎小管上皮細胞發現，30 mmol/L葡萄糖通過激活活性氧介導的NF-κB信號通路，誘導HK-2人腎小管上皮細胞NF-κBp65及α-SMA表達升高，細胞發生轉分化，賀今等[19]在動物研究中報道，苯能夠誘導骨髓細胞活性氧(ROS)表達增高，阻滯造血干細胞S期，最終出現苯所致小鼠再生障礙性貧血。這再次證明ROS阻斷了線粒體呼吸鏈的傳遞，抑制了細胞的代謝，引起細胞有絲分裂周期延長[19]，致使細胞增殖能力降低有關，該研究結果與Shen L、張磊、賀今等學者的觀點和研究結果相符，即高糖環境下mBMSC的A值明顯降低。與高糖對照組相比，高糖CM組和高糖BCA-1CM組mBMSC的A值逐漸增加，這可能是高糖環境使mASMC產生ROS、氧自由基等有害物質，mASMC能啟動、釋放清除氧自由基的超氧化物歧化酶等抗氧化酶家族成員有關。岳萌等[20]在鏈脲佐菌素誘導聯合大腦中動脈栓塞動物模型的缺血再灌注后5、24 h收集腦組織，利用免疫熒光等試驗均發現ROS增加的同時，腦組織抗氧化酶的表達也呈現逐漸增多的趨勢，或Huang F等[21]研究高濃度葡萄糖誘導的人系膜細胞中也發現，高糖組人系膜細胞釋放IL-8、TNF-1α等炎癥因子，以維持細胞自身生存或能量供給，該研究結果也發現與對照組相比，高糖對照組IL-8蛋白表達增高，富含白介素等細胞因子的mASMC條件培養基培養mBMSC，促進了高糖環境下mBMSC的增殖。

高糖BCA-1CM組mBMSC的A值明顯增加，并結合mASMC內Akt蛋白含量與其他組相比，有較大上調的ELISA研究結果，認為BCA-1與mASMC表面CXCR5相結合[12]，啟動了mASMC內部的PI3K-Akt信號通路。張超等[22]研究發現，Akt信號通路是經典而復雜的信號網絡，其主要作用為維持細胞穩態，促進細胞增殖、分化和運動。PI3K蛋白是激活Akt信號通路的關鍵原件，PI3K被激活后可進一步磷酸化Akt信號通路。此外，Akt通路還與人肺成纖維細胞分泌IL-6、IL-8等細胞因子密切相關[23]。該研究也發現BCA-1促進mASMC分泌IL-8，IL-8能促進MSC在高糖環境下增殖，降低MSC凋亡，并能夠招募MSC歸巢運動，Hou Y等[24]研究發現IL-8不僅增強人骨髓MSC歸巢，還能夠促進人骨髓MSC表達VEGF蛋白，加速血管生成潛能。BCA-1與CXCR5結合的信號過程被PI3K抑制劑阻斷，抑制了PI3K-Akt信號通路的活化，導致mASMC旁分泌障礙，進而使mBMSC的A值降低。

為了驗證BCA-1處理的mASMC對mBMSC凋亡的影響，采用兩種細胞凋亡研究方法。研究均發現各組mBMSC凋亡的情況與mBMSC的A值趨勢明顯相反。與正常對照組相比，高糖對照組mBMSC的Caspase-8蛋白的相對表達量和細胞凋亡率增高的原因是由于mBMSC群落為對抗高糖損傷，部分衰老的細胞率先出現凋亡現象，為其余細胞提供能量和營養物質，以維持細胞整體的生長。Davydov VV等[25]研究認為氧化應激及凋亡反應的生理意義在于避免細胞接觸有害物質的損傷，促進細胞集落的生長，這是機體的本能反應機制的細胞生物學表現形式。高糖BCA-1CM組mBMSC的Caspase-8蛋白相對表達量降低，而高糖PI3K抑制劑CM組的Caspase-8蛋白相對表達量又升高，進一步提示BCA-1激活mASMC內PI3K-Akt信號通路，促進mASMC表達IL-8等細胞因子上調mBMSC的增殖，抑制細胞凋亡的表達。

綜上所述，高糖環境下，BCA-1能夠通過激活mASMC內的PI3K-Akt信號，發揮保護MSC對抗高糖環境的作用。后續研究還將建立糖尿病足動物模型，在動物研究水平，闡述BCA-1通過ASMC招募MSC的效果和機制。