高糖環(huán)境下BCA-1通過血管平滑肌細胞對間充質(zhì)干細胞增殖和凋亡的影響

李永濤，沈雷，張善強，姜楊，孫石柱

齊齊哈爾醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

糖尿病患者全球約4.51億人[1]，我國糖尿病患發(fā)病率保守估計約為11%[2]。控制糖尿病及其并發(fā)癥卻不理想。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells,MSC）作為細胞治療的首選細胞被用于多種疾病的治療[3-5]。提高MSC歸巢效率將促進MSC的再生修復(fù)能力。B淋巴細胞化學引誘物-1（b-lymphocyte chemical attractants-1，BCA-1）又稱趨化因子13（CXC motif chemokine ligand 13,CXCL-13），不僅作為判斷肝癌預(yù)后的良好指標[6]，還可以激活CXCR5/ERK信號通路而加速乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移[7]。CXCL-13可以降低癌細胞免疫原性，在腫瘤免疫逃避中發(fā)揮作用[8]。此外發(fā)現(xiàn)MSC分泌的CXCL-13可促進骨髓瘤細胞侵襲，增加耐藥性[9]。也有研究發(fā)現(xiàn)，BCA-1結(jié)合于MSC的CXCR5受體，誘導(dǎo)MSC成骨分化、成肌腱分化，在肌腱-骨愈合過程中發(fā)揮再生修復(fù)作用[10-11]。缺氧環(huán)境下，BCA-1通過MAPK/NFκB信號通路促進MSC自噬和增殖[12]。因此，BCA-1可能在招募MSC遷移或降低MSC低免疫原性等“干性”作用中發(fā)揮著重要作用。

MSC由血管遷移到組織是MSC穿過血管的過程，目前還不清楚BCA-1招募MSC歸巢與血管平滑肌細胞的關(guān)系。該研究在細胞高糖模型下，以BCA-1刺激主動脈平滑肌細胞（aortic smooth muscle cells，ASMC）的上清液制備條件培養(yǎng)基，觀察各組ASMC對MSC增殖和凋亡作用及分子機制，為BCA-1誘導(dǎo)MSC歸巢穿越血管壁，治療糖尿病及其并發(fā)癥提供研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠主動脈平滑肌細胞（mASMC）、小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（mBMSC）均購自深圳豪地華拓生物科技有限公司；小鼠BCA-1重組蛋白購自武漢艾美捷科技有限公司；LY294002重組蛋白購自美國Selleck公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、α-MEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司；Annexin VFITC/PI細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；CCK-8購自日本Dojindo公司；苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠IL-8、Akt、磷酸化-Akt（Phosphorylation-Akt,p-Akt）蛋白的ELISA試劑盒購自美國R&D公司。兔抗小鼠Caspase-8、兔抗小鼠β-actin和HRP標記羊抗兔IgG購于Abcam公司。美國Molecular Devices公司的Emax酶標儀；美國BD公司的FACSAria II型流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞高糖模型 含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基為細胞高糖培養(yǎng)基，用細胞高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞為高糖細胞模型[13]。

1.2.2 mASMC培養(yǎng)與分組 含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)mASMC。正常條件下培養(yǎng)的mASMC為正常對照組。高糖環(huán)境下培養(yǎng)的mASMC為高糖對照組；以50 ng/mL BCA-1刺激者為高糖BCA-1組；若預(yù)先加入10μmol/L LY294002培養(yǎng)60 min，0.01 mmol/L PBS清洗后，再以50 ng/mL BCA-1刺激則為高糖PI3K抑制劑組。

1.2.3 條件培養(yǎng)基1.5×105各組mASMC，在37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h后，取上清液；1 000 r/min離心5 min，0.22μm濾器抽濾；與mBMSC培養(yǎng)基按1:5稀釋，即為各組mASMC的條件培養(yǎng)基（Conditioned medium，CM）[13]，用于培養(yǎng)mBMSC。

1.2.4 mBMSC培養(yǎng)與分組 含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)mBMSC。正常條件下培養(yǎng)mBMSC為正常對照組：高糖環(huán)境下無任何刺激者為高糖對照組。以mASMC的高糖對照組CM、高糖BCA-1組CM和高糖PI3K抑制劑組CM培養(yǎng)的mBMSC，分別為高糖CM組、高糖BCA-1CM組和高糖PI3K抑制劑CM組。

1.2.5 CCK-8實驗 8.0×103mBMSC培養(yǎng)在96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h；0.01 mmol/L PBS清洗3次，1 min/min。按照mBMSC分組而加入相應(yīng)的培養(yǎng)基或試劑，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。各孔加入CCK-8溶液10μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)2 h后，Emax酶標儀于450 nm處檢測各組mBMSC吸光度值（Absorbance value，A）。

1.2.6 流式細胞凋亡實驗 2.0×105各組mBMSC細胞重懸于1.25%Annexin V-FITC溶液中，室溫孵育15 min，4℃，10 000 r/min離心5 min后，加入等體積的2%PI溶液，冰上孵育2 min，4℃，10 000 r/min離心5 min后，0.01 mmol/L PBS重懸，F(xiàn)ACSAria II流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 West er n bl ot 含1 mmol/L PMSF的細胞裂解液裂解各組5.0×106 mBMSC，4℃，12 000 r/min離心60 min。BCA蛋白濃度測定試劑盒定量。濃縮膠75 V電泳30 min，分離膠110 V電泳45 min；75 V轉(zhuǎn)膜2 h至硝酸纖維素膜。脫脂奶粉封閉后，加入兔抗小鼠Caspase-8抗體 （1∶550），兔抗小鼠β-actin抗體（1:800），4℃過夜后；加入HRP標記羊抗兔IgG（1∶500），室溫孵育120 min；滴加ECL試劑，Tanon 6 200發(fā)光成像工作站顯影。Image-Pro Plus 6.0.1圖像分析軟件檢測各蛋白條帶的相對光密度值 （Optical density value,OD），并計算各蛋白的相對表達量。

1.2.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）提取5.0×106各組mASMC上清液，小鼠IL-8蛋白ELISA試劑盒檢測各組mASMC上清液中IL-8蛋白含量。含1 mmol/L PMSF的裂解液裂解各組mASMC，4℃，12 000 r/min離心8 min，提取各組細胞裂解液。小鼠Akt、p-Akt蛋白ELISA試劑盒檢測各組mASMC裂解液中Akt、p-Akt蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Q檢驗；計數(shù)資料用[n(%)]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組條件培養(yǎng)基對mBMSC增殖的影響

正常對照組、高糖對照組、高糖CM組、高糖BCA-1CM組、高糖PI3K抑制劑CM組mBMSC的A值分別為（1.47±0.20）、（0.62±0.39）、（0.85±0.22）、（1.31±0.15）、（0.53±0.34），差異有統(tǒng)計學意義（F=80.33，P＜0.01）。高糖對照組A值是正常對照組的0.42倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；高糖對照CM組A值是高糖對照組的1.37倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高糖BCA-1CM組A值是高糖對照CM組1.54倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；高糖PI3K抑制劑CM組A值是高糖BCA-1CM組的0.40倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。結(jié)果提示高糖環(huán)境下，BCA-1刺激的mASMC條件培養(yǎng)基能促進mBMSC增殖。

圖1 CCK-8實驗檢測各組mBMSC增殖

2.2 各組條件培養(yǎng)基對mBMSC凋亡率的影響

各組mBMSC的細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。高糖對照組mBMSC細胞凋亡率是正常對照組的2.02倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；高糖BCA-1CM組mBMSC細胞凋亡率是高糖CM組的62.2%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；高糖PI3K抑制劑CM組mBMSC凋亡率是高糖BCA-1CM組的1.37倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 流式細胞術(shù)分析各組mBMSC凋亡

2.3 各組條件培養(yǎng)基對mBMSC的Caspase-8蛋白表達的影響

為了進一步驗證各組條件培養(yǎng)基對mBMSC凋亡的影響，Western blot檢測各組mBMSC的Caspase-8蛋白表達。正常對照組、高糖對照組、高糖CM組、高糖BCA-1CM組、高糖PI3K抑制劑CM組的Caspase-8蛋白相對表達量分別為（0.52±0.03）、（0.75±0.08）、（0.70±0.06）、（0.42±0.04）、（1.10±0.01），差異有統(tǒng)計學意義（F=488.00，P＜0.01）。高糖對照組Caspase-8蛋白是正常對照組的1.44倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；高糖CM組Caspase-8蛋白是高糖對照組的0.93倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高糖BCA-1CM組Caspase-8蛋白是高糖CM組0.60倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；高糖PI3K抑制劑CM組Caspase-8蛋白是高糖BCA-1CM組2.38倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖3。兩種細胞凋亡實驗結(jié)果均提示高糖環(huán)境下，BCA-1通過激活mASMC內(nèi)PI3K信號通路，受BCA-1刺激的mASMC條件培養(yǎng)基能降低mBMSC凋亡。

圖3 Western blot法檢測各組mBMSC的Caspase-8蛋白表達

2.4 BCA-1對mASMC的Akt、p-Akt、IL-8蛋白表達的影響

ELISA檢測各組mASMC裂解液中Akt、p-Akt蛋白含量。高糖對照組的Akt、p-Akt蛋白量分別是正常對照組的1.27倍、1.06倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；高糖BCA-1組的Akt、p-Akt蛋白含量分別是高糖對照組的1.54倍、1.40倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；高糖PI3K抑制劑組的Akt、p-Akt蛋白含量分別是高糖BCA-1組的0.68倍、0.79倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。ELISA檢測各組mASMC上清液中IL-8含量發(fā)現(xiàn)，高糖對照組的IL-8蛋白量是正常對照組的1.50倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；高糖BCA-1組的IL-8蛋白含量是高糖對照組的1.92倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；高糖PI3K抑制劑組的IL-8蛋白含量是高糖BCA-1組的0.77倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見表1。這說明BCA-1激活mASMC內(nèi)Akt通路，促進mASMC表達IL-8蛋白，PI3K抑制劑能夠阻斷這一過程。

表1 BCA-1對mASMC的Akt、p-Akt蛋白表達的影響[（±s），μg/mL]

表1 BCA-1對mASMC的Akt、p-Akt蛋白表達的影響[（±s），μg/mL]

注:a P＜0.001，與正常對照組比較；b P＜0.001，與高糖對照組比較；c P＜0.001，與高糖BCA-1組比較

指標正常對照組（n=16）高糖對照組（n=16）高糖BCA-1組（n=16）高糖PI3K抑制劑組（n=16）F值 P值A(chǔ)kt p-Akt IL-8 6.03±0.14 5.16±0.09 2.38±0.34（7.71±0.29）a（5.48±0.15）a（3.57±0.28）a（11.85±0.18）b（7.69±0.13）b（6.84±0.21）b（8.16±0.24）c（6.10±0.12)c(5.33±0.67)c 1987.68 1308.22 357.74<0.001<0.001<0.001

3 討論

糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥造成患者生活質(zhì)量的下降[14]。胰腺及胰島細胞的移植雖可解決上述弊端，但由于供體來源短缺，易出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，致使移植手術(shù)難以在臨床廣泛推廣[15]。體內(nèi)分布廣泛的MSC具有容易提取、易于培養(yǎng)、多分化性、低免疫原性等特點，為糖尿病及其并發(fā)癥的治療帶來希望。趨化因子是一族小的多肽，主要作用為活化細胞，促進細胞運動[16]。研究發(fā)現(xiàn)MSC可表達CCR1、CCR7、CCR9、CXCR4、CXCR5等多種趨化因子配體[8]，趨化因子可促進MSC等細胞歸巢并在組織中集聚[17]。BCA-1（CXC13）可與MSC表達的CXCR5配體結(jié)合，促進人骨髓MSC的增殖和自噬[12]，并能夠提高MSC成骨分化的能力[10]，BCA-1提高了大鼠損傷肌腱張力負荷水平，促進小鼠C3HIOT1/2間充質(zhì)細胞系ERK1/2、JNK和p38蛋白的表達，提高C3HIOT1/2細胞成骨能力[10]。但是BCA-1在高糖環(huán)境下對MSC增殖或凋亡的影響卻鮮見報道。

該研究探討高糖環(huán)境下，BCA-1處理的ASMC對MSC增殖和凋亡的影響。30 mmol/L葡萄糖建立的細胞高糖模型相當于血糖濃度540 mg/dl，Shen L等[13]也據(jù)此建立細胞高糖模型，是比較認可的細胞高糖模型。高糖對照組mBMSC的A值與正常對照組相比，出現(xiàn)明顯降低，其原因可能與高糖環(huán)境導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧、氧自由基等物質(zhì)增多有關(guān)。張磊等[18]研究HK-2正常人近端腎小管上皮細胞發(fā)現(xiàn)，30 mmol/L葡萄糖通過激活活性氧介導(dǎo)的NF-κB信號通路，誘導(dǎo)HK-2人腎小管上皮細胞NF-κBp65及α-SMA表達升高，細胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，賀今等[19]在動物研究中報道，苯能夠誘導(dǎo)骨髓細胞活性氧(ROS)表達增高，阻滯造血干細胞S期，最終出現(xiàn)苯所致小鼠再生障礙性貧血。這再次證明ROS阻斷了線粒體呼吸鏈的傳遞，抑制了細胞的代謝，引起細胞有絲分裂周期延長[19]，致使細胞增殖能力降低有關(guān)，該研究結(jié)果與Shen L、張磊、賀今等學者的觀點和研究結(jié)果相符，即高糖環(huán)境下mBMSC的A值明顯降低。與高糖對照組相比，高糖CM組和高糖BCA-1CM組mBMSC的A值逐漸增加，這可能是高糖環(huán)境使mASMC產(chǎn)生ROS、氧自由基等有害物質(zhì)，mASMC能啟動、釋放清除氧自由基的超氧化物歧化酶等抗氧化酶家族成員有關(guān)。岳萌等[20]在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)聯(lián)合大腦中動脈栓塞動物模型的缺血再灌注后5、24 h收集腦組織，利用免疫熒光等試驗均發(fā)現(xiàn)ROS增加的同時，腦組織抗氧化酶的表達也呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢，或Huang F等[21]研究高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的人系膜細胞中也發(fā)現(xiàn)，高糖組人系膜細胞釋放IL-8、TNF-1α等炎癥因子，以維持細胞自身生存或能量供給，該研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)與對照組相比，高糖對照組IL-8蛋白表達增高，富含白介素等細胞因子的mASMC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)mBMSC，促進了高糖環(huán)境下mBMSC的增殖。

高糖BCA-1CM組mBMSC的A值明顯增加，并結(jié)合mASMC內(nèi)Akt蛋白含量與其他組相比，有較大上調(diào)的ELISA研究結(jié)果，認為BCA-1與mASMC表面CXCR5相結(jié)合[12]，啟動了mASMC內(nèi)部的PI3K-Akt信號通路。張超等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Akt信號通路是經(jīng)典而復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，其主要作用為維持細胞穩(wěn)態(tài)，促進細胞增殖、分化和運動。PI3K蛋白是激活A(yù)kt信號通路的關(guān)鍵原件，PI3K被激活后可進一步磷酸化Akt信號通路。此外，Akt通路還與人肺成纖維細胞分泌IL-6、IL-8等細胞因子密切相關(guān)[23]。該研究也發(fā)現(xiàn)BCA-1促進mASMC分泌IL-8，IL-8能促進MSC在高糖環(huán)境下增殖，降低MSC凋亡，并能夠招募MSC歸巢運動，Hou Y等[24]研究發(fā)現(xiàn)IL-8不僅增強人骨髓MSC歸巢，還能夠促進人骨髓MSC表達VEGF蛋白，加速血管生成潛能。BCA-1與CXCR5結(jié)合的信號過程被PI3K抑制劑阻斷，抑制了PI3K-Akt信號通路的活化，導(dǎo)致mASMC旁分泌障礙，進而使mBMSC的A值降低。

為了驗證BCA-1處理的mASMC對mBMSC凋亡的影響，采用兩種細胞凋亡研究方法。研究均發(fā)現(xiàn)各組mBMSC凋亡的情況與mBMSC的A值趨勢明顯相反。與正常對照組相比，高糖對照組mBMSC的Caspase-8蛋白的相對表達量和細胞凋亡率增高的原因是由于mBMSC群落為對抗高糖損傷，部分衰老的細胞率先出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，為其余細胞提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)，以維持細胞整體的生長。Davydov VV等[25]研究認為氧化應(yīng)激及凋亡反應(yīng)的生理意義在于避免細胞接觸有害物質(zhì)的損傷，促進細胞集落的生長，這是機體的本能反應(yīng)機制的細胞生物學表現(xiàn)形式。高糖BCA-1CM組mBMSC的Caspase-8蛋白相對表達量降低，而高糖PI3K抑制劑CM組的Caspase-8蛋白相對表達量又升高，進一步提示BCA-1激活mASMC內(nèi)PI3K-Akt信號通路，促進mASMC表達IL-8等細胞因子上調(diào)mBMSC的增殖，抑制細胞凋亡的表達。

綜上所述，高糖環(huán)境下，BCA-1能夠通過激活mASMC內(nèi)的PI3K-Akt信號，發(fā)揮保護MSC對抗高糖環(huán)境的作用。后續(xù)研究還將建立糖尿病足動物模型，在動物研究水平，闡述BCA-1通過ASMC招募MSC的效果和機制。