rmIL-4和rmGM-CSF聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)小鼠骨髓造血干細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化的結(jié)果

趙商岐，夏開德，武娟，周彥霞，劉玉武，周文濤，周曉濤

1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，烏魯木齊830011；2貴陽市婦幼保健院；3新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院

抗原提呈細(xì)胞（APC）是抗原進(jìn)入機(jī)體后引發(fā)免疫反應(yīng)的第一關(guān)［1］，其中，樹突狀細(xì)胞（DC）是機(jī)體功能最強(qiáng)的APC，起源于造血干細(xì)胞［2］。DC功能的發(fā)揮與自身的活化與成熟密不可分［3］。DC包括未成熟DC、成熟DC，在免疫反應(yīng)中作用不同。未成熟DC有較強(qiáng)的抗原內(nèi)吞和加工處理能力，而成熟DC則高表達(dá)MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子CD86等［4］，具有較強(qiáng)的抗原提呈能力，能夠特異性激活初始T細(xì)胞。近幾年，在病原體感染免疫及相關(guān)疫苗研制等領(lǐng)域?qū)C功能的研究越來越多［5］。然而，DC在外周組織中含量極低，體外分離難以獲得大量的DC，需要建立成熟的DC誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)，以獲得高純度的DC。2021年4—6月，本研究聯(lián)合應(yīng)用rmIL-4和rmGM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓造血干細(xì)胞向DC分化，并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、表型、抗原捕獲能力鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 小鼠、試劑及儀器 SPF級(jí)C57小鼠，6～8周，體質(zhì)量17～23 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自BI公司，1%青鏈霉素購自Hyclone公司，紅細(xì)胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，重組小鼠白細(xì)胞介素-4（rmIL-4）、重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）購自Peprotech公司，流式單克隆抗體CD11c+、CD86+、CD45+配體、Ⅰ-Ab與anti-HIS Tag抗體購自BD biosciences公司，HISEgG1Y162抗原由本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存。高速臺(tái)式低溫離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，電泳儀購自美國Bio-Rad公司，電泳槽購自SUB-CELL GT公司，溫控?fù)u床購自上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，凝膠成像儀購自BIO-RAD公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，超凈工作臺(tái)購自中國Heal Force公司，光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，倒置顯微鏡購自德國LEICA公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司。

1.2 小鼠骨髓造血干細(xì)胞來源DC的誘導(dǎo)方法取6～8周的C57小鼠，頸椎脫臼法處死，浸入75%的乙醇中10 min，無菌條件下剝除肌肉組織，取出股骨和脛骨，將股骨和脛骨浸入70%的乙醇中0.5 min，浸泡2次，用PBS緩沖液洗去乙醇，重復(fù)4次。剪去股骨和脛骨兩端，用5 mL的注射器吸取5 mL PBS緩沖液后插入骨骺，用力推出骨髓，反復(fù)沖洗直至骨變白。用移液槍反復(fù)吹打沖洗下來的骨髓至細(xì)胞完全分散，然后用無菌200目濾網(wǎng)過濾細(xì)胞到15 mL離心管中，除去組織碎片，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入3 mL紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻，4℃裂解10 min；加PBS緩沖液至10 mL，終止紅細(xì)胞裂解，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清。骨髓細(xì)胞用含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸浮，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋為3×106/mL的細(xì)胞懸液，接種到6孔板中，每孔3 mL，同時(shí)加入終濃度20 ng/mL的rmIL-4和終濃度10 ng/mL的rmGMCSF，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日半量換液。

1.3 小鼠骨髓造血干細(xì)胞來源DC的鑒定方法

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 第0、3、8、12天時(shí)，取誘導(dǎo)完成的細(xì)胞培養(yǎng)液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀況。

1.3.2 細(xì)胞表型鑒定 采用流式細(xì)胞術(shù)。誘導(dǎo)第0、6、12天時(shí)收集細(xì)胞，加入2 mL PBS緩沖液輕輕吹打混勻后，4℃條件下1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入50μL含有1μL CD11c+抗體、1μL CD86+抗體與1μL CD45+配體抗體的PBS緩沖液，4℃避光孵育30 min；加入1 mL PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，4℃條件下1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞；加入300μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，70μm濾器過濾細(xì)胞懸液，使用流式細(xì)胞儀檢測CD45+細(xì)胞數(shù)、CD11c+CD86+細(xì)胞數(shù)，計(jì)算CD45+的細(xì)胞中CD11c+CD86+細(xì)胞占比。

1.3.3 細(xì)胞抗原捕獲能力鑒定及成熟度觀察 誘導(dǎo)第6天時(shí)，收集細(xì)胞懸液培養(yǎng)于6孔板中，每孔加入500 ng/mL HIS-EgG1Y162抗原，分別于培養(yǎng)12、24 h后收集細(xì)胞懸液。取收集的細(xì)胞懸液，每管加入2 mL PBS緩沖液輕輕吹打混勻后，4℃條件下1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入50μL含有1μL Anti-HiS Tag抗體、1μL CD86+抗體、1μL CD11c+、1μL CD45+抗體與1μLⅠ-Ab抗體的PBS緩沖液，4℃避光孵育30 min，加入1 mL PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，4℃條件下1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，加入300μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，70μm濾器過濾細(xì)胞懸液，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞總數(shù)、結(jié)合HIS-EgG1Y162抗原的細(xì)胞數(shù)、CD45+細(xì)胞數(shù)、CD11c+CD86+細(xì)胞數(shù)、CD11 c+MHC-Ⅱ+細(xì)胞數(shù)，計(jì)算結(jié)合HIS-EgG1Y162抗原的細(xì)胞占比、CD45+的細(xì)胞中CD11c+CD86+細(xì)胞占比、CD45+的細(xì)胞中CD11c+MHC-Ⅱ+細(xì)胞占比。以結(jié)合HIS-EgG1Y162抗原的細(xì)胞占比表示細(xì)胞抗原捕獲能力，以CD45+的細(xì)胞中CD11c+CD86+、CD11c+MHC-Ⅱ+細(xì)胞占比表示細(xì)胞成熟度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 誘導(dǎo)第0、3、8、12天時(shí)的細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可見，誘導(dǎo)第0天時(shí)，細(xì)胞體積較小，形態(tài)規(guī)則，呈類圓形懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中；誘導(dǎo)第3天時(shí)，細(xì)胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，少量細(xì)胞開始出現(xiàn)“偽足”，細(xì)胞成團(tuán)生長且數(shù)量開始增多；誘導(dǎo)第8天時(shí)，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的“突觸”，細(xì)胞呈多邊形聚集于培養(yǎng)皿中央；誘導(dǎo)第12天時(shí)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，突觸明顯變長，集落細(xì)胞團(tuán)形成。

圖1 誘導(dǎo)第0、3、8、12天時(shí)的細(xì)胞形態(tài)（×400）

2.2 細(xì)胞表型鑒定結(jié)果 誘導(dǎo)第0、6、12天時(shí)，CD45+的細(xì)胞中CD11c+CD86+細(xì)胞占比分別為1.170%±0.302%、6.120%±0.245%、16.000%±0.294%，兩兩比較，P均<0.05。

2.3 細(xì)胞抗原捕獲能力鑒定結(jié)果及細(xì)胞成熟情況 誘導(dǎo)第6天時(shí)，加入HIS-EgG1Y162抗原共培養(yǎng)12 h后，結(jié)合HIS-EgG1Y162抗原的樹突狀細(xì)胞占比為1.760%±0.065%，CD45+的細(xì)胞中CD11c+CD86+、CD11c+MHC-Ⅱ+細(xì)胞占比分別為8.67%±0.38%、11.90%±0.49%。；加入HIS-EgG1Y162抗原共培養(yǎng)24 h后，結(jié)合HIS-EgG1Y162抗原的樹突狀細(xì)胞占比為13.400%±0.408%，CD45+的細(xì)胞中CD11c+CD8 6+、CD11c+MHC-Ⅱ+細(xì)胞占比分別為20.10%±0.29%、16.70%±0.24%；兩者相比，P均<0.05。

3 討論

DC廣泛分布于全身除腦以外的各組織器官中，是生物體內(nèi)主要的專職APC，在腫瘤免疫［6］、寄生蟲感染與免疫應(yīng)答中起重要作用［7-8］。DC的分化與成熟可分為4個(gè)階段，據(jù)此可將其分為4類：前體細(xì)胞、未成熟的樹突狀細(xì)胞（imDC）、遷移期DC與成熟的樹突狀細(xì)胞（mDC）［9］。DC的前體細(xì)胞尚無表型及功能，但在細(xì)胞因子或感染情況下可轉(zhuǎn)化為imDC。DC前體細(xì)胞向imDC轉(zhuǎn)化過程中高表達(dá)與吞噬有關(guān)的膜受體，因此具有較強(qiáng)的抗原攝取及加工能力，可誘導(dǎo)與維持抗原特異性免疫耐受，為獲得性免疫所必需［10］。經(jīng)病原體刺激后，imDC發(fā)生遷移分化為mDC，失去吞噬相關(guān)受體，并高表達(dá)MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子CD86等，可將抗原進(jìn)一步呈遞給初始T細(xì)胞，使之激活，從而啟動(dòng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)［11-12］。由于DC在體內(nèi)血液及組織中含量極低，體外僅可存活數(shù)天，極大的限制了DC的研究，如何建立成熟的DC誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)、獲得大量的DC已成為開展免疫學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。

目前，獲得DC的方法主要有梯度離心法［13］與誘導(dǎo)擴(kuò)增法。梯度離心法是從外周血中利用免疫磁珠或流式細(xì)胞儀等方法分離DC，此方法獲得的DC純度高，但是細(xì)胞數(shù)量少，分離的DC處于不同的分化階段，而且一旦單抗選擇不當(dāng)，很容易丟失部分DC。誘導(dǎo)擴(kuò)增法可用細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)不同來源的前體細(xì)胞獲得DC。研究［14］表明，GM-CSF在DC培養(yǎng)中可促進(jìn)單核細(xì)胞向巨噬樣細(xì)胞分化，增強(qiáng)抗原提呈能力，IL-4可抑制單個(gè)核細(xì)胞分化為中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，從而引導(dǎo)單核細(xì)胞向DC分化，因此經(jīng)GM-CSF和IL-4體外誘導(dǎo)外周血、脾臟等器官來源的前體細(xì)胞，可沿不同的分化途徑擴(kuò)增為DC；但是，脾臟及外周血來源的DC不僅產(chǎn)量少且誘導(dǎo)周期長，無法滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)DC數(shù)量及功能的需求。于是，我們通過體外分離小鼠骨髓來源的造血干細(xì)胞經(jīng)rmGM-CSF和rmIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)，從而獲得骨髓來源的DC。因骨髓來源的前體細(xì)胞具有含量多、取材方便等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)誘導(dǎo)擴(kuò)增可獲得大量高純度的DC。

與其他免疫細(xì)胞不同，DCs是一類具有不同分化階段的異質(zhì)細(xì)胞群，且各階段具備差異性細(xì)胞形態(tài)及免疫功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在DC誘導(dǎo)培養(yǎng)中，倒置顯微鏡下可見初時(shí)細(xì)胞體積較小，呈類圓形懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中。在誘導(dǎo)第3天時(shí)，少量細(xì)胞開始出現(xiàn)“偽足”，細(xì)胞成團(tuán)生長且數(shù)量開始增多。在誘導(dǎo)第8天時(shí)，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的“突觸”聚集于培養(yǎng)皿中央。在誘導(dǎo)第12天時(shí)，突觸明顯變長，集落細(xì)胞團(tuán)形成，已基本具備典型的DC形態(tài)。CD11c高表達(dá)于髓系DC表面。本研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)DC細(xì)胞分化過程中，隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加，CD45+的免疫細(xì)胞中，CD11c+CD86+細(xì)胞明顯增高，表明此體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法可獲得大量高純度的小鼠骨髓造血干細(xì)胞來源的DC。在病原體感染的免疫應(yīng)答中，DC在抗原刺激下可分化為成熟DC，并誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。DC的功能狀態(tài)在一定程度上反應(yīng)了機(jī)體免疫應(yīng)答能力，并且隨著DCs的發(fā)育成熟，捕獲抗原的能力逐漸下降，因此我們收集誘導(dǎo)第6天的DC，將細(xì)粒棘球絳蟲特異性抗原HIS-EgG1Y162與DC共培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞術(shù)分析DC表面的蛋白結(jié)合情況從而檢測DC的抗原捕獲能力，發(fā)現(xiàn)隨著與抗原共培養(yǎng)時(shí)間的延長，DC的蛋白結(jié)合百分率明顯增強(qiáng)，此外，在大量抗原刺激下，成熟DC百分率也隨之增高。

綜上所述，本研究使用rmIL-4和rmGM-CSF刺激小鼠骨髓造血干細(xì)胞，獲得了不同分化階段的DC，且獲得的成熟DC具有較強(qiáng)的抗原捕獲能力，這為后期開展DC相關(guān)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。