消毒方式對綠豆愈傷組織培養的影響

王珅 范保杰 王彥 曹志敏 蘇秋竹 張志肖 劉長友 田靜

摘要 為明確綠豆愈傷組織培養體系中最佳種子消毒方式，利用乙醇、次氯酸鈉（NaClO）、氯化汞（HgCl2）和氯氣（Cl2）作為消毒劑，組合搭配16種消毒方式對綠豆種子進行消毒處理。對發芽率、污染率、種皮破損率及愈傷組織誘導率等指標進行綜合評價分析。結果表明，75%乙醇 30 s+1.0% NaClO 10 min的消毒方式處理的綠豆種子發芽率為90.11%，該處理無污染，種皮無破損，出愈率達到92%，誘導的愈傷組織呈黃綠色塊狀，結構緊密且質地硬，生長速率與生長狀況良好。因此，該消毒方式適用于綠豆愈傷組織培養過程中的種子消毒，且有利于綠豆子葉節的愈傷誘導。

關鍵詞 綠豆;種子;消毒方式;愈傷誘導

中圖分類號 S 522? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）23-0029-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.008

Effects of Different Disinfection Methods on Callus Culture of Mung Bean（Vigna radiata）

WANG Shen， FAN Bao-jie， WANG Yan et al

（Institute of Cereal and Oil Crops， Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Hebei Laboratory of Crop Genetic and Breeding， Shijiazhuang， Hebei 050035）

Abstract In order to determine the best disinfection method of mung bean seeds in callus culture system， 16 disinfection methods were used to disinfect mung bean seeds with ethanol / NaClO / HgCl2 and chlorine as disinfectants. In addition， the germination rate， pollution rate， seed coat damage rate and callus induction rate were comprehensively evaluated and analyzed. The results showed that the germinating rate of mung bean seeds treated with 75% ethanol for 30 s+1.0% NaClO for 10 min was 90.11%， and there was no pollution， the seed coat was not damaged， the callus induction rate was 92%， and the callus was light yellow green， compact in structure and hard in texture. Therefore， this method was suitable for seed disinfection in the process of mung bean callus culture and is conducive to the callus induction of mung bean cotyledon node.

Key words Mung bean;Seed;Disinfection method;Callus induction

基金項目 國家重點研發計劃項目（2019YFD1000700/2019YFD1000703）;河北省農林科學院糧油作物研究所青年創新基金課題（2020LYS02）;國家食用豆產業技術體系（CARS-08）;河北省現代產業技術體系雜糧雜豆創新團隊（HBCT2018070203）;河北省農林科學院創新工程（2019-4-2-8）。

作者簡介 王珅（1986—），男，河北石家莊人，助理研究員，碩士，從事綠豆遺傳育種研究。通信作者：田靜，研究員，碩士，從事綠豆遺傳育種研究;劉長友，副研究員，博士，從事綠豆遺傳育種研究。田靜和劉長友為共同通信作者。

收稿日期 2021-03-24

綠豆[Vigna radiata（Linn.）Wilczek]古名菉豆、植豆，屬豆科（Leguminosae），蝶形花亞科（Papilionoideae），豇豆屬（Vigna）。富含蛋白質及多種抗氧化活性物質，在現代飲食結構中具有平衡膳食、清熱解毒、消暑利水等作用[1-2]。綠豆作為一種小宗雜糧作物，系統選育、雜交選育及輻照育種等常規方法仍是綠豆育種的主要手段。鑒于常規育種局限性與生物技術的快速發展，有必要對綠豆開展轉基因育種研究。再生體系建立是利用基因工程技術進行品種改良的重要環節，合適的消毒方式對于高效再生體系建立具有重要影響。

植物組織再生過程中常見消毒方式包括75%乙醇消毒法、次氯酸鈉消毒法、氯氣消毒法和氯化汞消毒法。吳鵬飛等[3]研究發現，75%乙醇消毒30 s對草莓花藥愈傷組織誘導效果較好。陳華濤等[4]利用1%、3%、5%次氯酸鈉對小豆種子分別進行10、20、30 min消毒處理，發現單一濃度次氯酸鈉隨處理時間延長消毒效果增強，且次氯酸鈉濃度升高也可提高消毒效果。陳新等[5]在建立小豆組織再生體系中利用了75%乙醇+5%次氯酸鈉的消毒方式。大豆再生體系中多采用氯氣消毒法。劉銀等[6]研究發現，氯氣消毒處理后的大豆種子萌發率達100%且污染率為0;李海燕等[7]也認為，氯氣對大豆種子消毒效果較好;劉海坤[8]通過研究不同時間氯氣處理對大豆種子消毒效果的影響，發現1～24 h氯氣消毒效果差異不大，消毒時間太長可能對種子傷害較大從而影響種子活力。范淑芳[9]采用75%乙醇+0.1%氯化汞對華中枸骨新梢莖段進行外植體消毒，獲得較好的消毒效果，該消毒方式對后期愈傷組織的形成與生長較好。氯化汞消毒法在豇豆[10]與菜豆[11]組織培養技術研究中為主要消毒方式，但綠豆組織培養體系中消毒方式還不明確。鑒于此，筆者針對綠豆消毒方法展開系統試驗，探討不同消毒方式對綠豆愈傷組織培養的影響，以期找到最佳消毒方式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗品種選用保綠942-34，由河北省農林科學院糧油作物研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理。選取健康、飽滿、無破損、大小均勻的綠豆種子置于燒杯中，將雜質漂洗干凈后放入超凈工作臺，參照已報道文獻[3-10]設置16種消毒方式（表1）。消毒處理后均用無菌水沖洗6次，洗去殘留消毒劑。

1.2.2

種子發芽。將消毒處理后的種子接種到MS基礎培養基中，每個培養皿接種30粒，封口膜封好后置于16 h光照/8 h黑暗的培養室中26 ℃培養5 d。每種消毒處理后的種子接種10皿，重復3次，統計污染率及無菌發芽率。

1.2.3 外植體制備。根據1.2.2的試驗結果，選用消毒效果好的O和P方式處理的綠豆幼苗，切除初生葉，取帶有3～5 mm上、下胚軸的子葉節作為外植體，接種在愈傷誘導培養基（MS+2，4-D 4 mg/L+6-BA 1 mg/L）上，每皿接種5～7個，設3次重復，14 d后統計出愈率。

1.3 數據統計與分析

發芽率=發芽種子數/接種種子數×100%

污染率=污染種子數/接種種子數×100%

無菌發芽率=無菌發芽種子數/接種種子數×100%

種皮破損率=種皮破損種子數/接種種子數×100%

出愈率=愈傷組織數/接種外植體數×100%。

采用Excel和DPS（v18.10高級版）軟件進行數據統計與分析;采用Duncan氏法對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方式處理對綠豆污染率與發芽率的影響

2.1.1 單獨消毒方式效果評價。

利用消毒方式A、B、C處理綠豆種子，培養5 d后種子發芽率均超過85%;種子污染率分別為64.11%、62.67%、62.33%。這表明單獨使用75%乙醇處理即使延長消毒時間也不能有效降低污染率，因此單獨使用75%乙醇處理不能獲得良好消毒效果。

利用消毒方式D、E、F、G、H、I、J、K、L處理綠豆種子，即濃度為1.0%、2.5%、5.0%次氯酸鈉分別處理綠豆成熟種子10、20、30 min都可有效滅菌，污染率均為0。但是隨著濃度升高以及處理時間延長會使發芽率降低（表2）。同一濃度次氯酸鈉隨著消毒時間延長綠豆種皮破損率明顯提升（表3）。種皮結構破壞后導致種子活性降低，影響發芽率。種皮破損的綠豆培養5 d后，發芽速率與生長狀態明顯低于正常綠豆（圖1）。

利用消毒方式M、N處理綠豆種子，結果顯示氯氣消毒效果較好，但綠豆發芽率卻顯著下降（表4）。原因可能是氯氣造成綠豆傷害，使其活性降低，隨著處理時間延長，傷害加重，從而導致發芽率降低。

單獨使用75% 乙醇（污染率高）或單獨使用NaClO（發芽率較低）都無法取得理想消毒效果。氯氣消毒導致綠豆發芽率顯著降低（46.33%）。

2.1.2 復合消毒方式效果評價。

利用復合消毒方式O和P，即75%乙醇30 s+1.0% NaClO 10 min與75%乙醇30 s+1% HgCl2 10 min均能夠達到污染率為0的理想消毒效果，消毒方式O的種子發芽率顯著高于消毒方式P（表5），且培養3 d后種子發芽速率與生長狀況明顯優于消毒方式P（圖2）。

該研究顯示，復合消毒方式對綠豆種子損傷效果較小，并且種子發芽率顯著高于單獨消毒方式（圖3）。

2.2 復合消毒方式對綠豆愈傷誘導的影響

采用消毒效果較好的O和P復合消毒方式處理后的綠豆種子，培養5 d后切取子葉節接種在愈傷誘導培養基（pH≈5.8）上。結果表明，在相同培養條件下O消毒方式處理后的子葉節愈傷組織誘導率較高，為92.5%，P消毒方式處理后的子葉節出愈率為80.0%。此外，經過O消毒方式處理后的愈傷組織呈黃綠色塊狀，結構緊密且質地硬，其生長速率與生長狀況優于P消毒方式（圖4）。

P消毒方式處理后的子葉節在愈傷組織誘導過程中出現了褐化現象（圖5），愈傷褐化率11.67 %，O消毒方式沒有出現褐化的愈傷。

2種復合消毒方式消毒效果相同，但P消毒方式不足之處在于發芽率與出愈率明顯低于消毒方式O，原因可能是消毒過程中氯化汞對外植體產生毒害作用，導致愈傷誘導率降低，這與陶興魁等[12]對藍莓外植體消毒方法比較的研究結果相近。綜上可知，75%乙醇30 s+1.0% NaClO 10 min更有利于綠豆子葉節誘導愈傷組織，是綠豆愈傷組織培養較為理想的消毒方式。

3 討論

發芽率能夠反映不同消毒方式處理后的綠豆種子活性，種子活性會影響到外植體質量，進而影響出愈率。研究發現，單一的次氯酸鈉消毒方式隨著濃度升高，發芽率明顯降低。氯氣有較強消毒效果，李海燕等[7]使用氯氣消毒法可對大豆成熟種子消毒且成功獲得再生大豆幼苗。在該研究中氯氣雖然能夠有效去除綠豆種子表面微生物，但發芽率顯著降低，這與陳華濤等[4]對小豆種子消毒方法研究結果一致。

消毒效果直接影響綠豆愈傷組織培養，單一的75%乙醇消毒處理時即使時間延長也不能獲得理想的無菌種子。濃度為2.5%及5.0%的次氯酸鈉處理10 min可有效除菌，但會對綠豆種皮產生較大傷害，加劇了種子活性損傷，導致發芽與生長速率降低。1%次氯酸鈉處理后的綠豆消毒效果較好，且發芽率較高，但隨著1%次氯酸鈉作用時間延長，發芽率降低，其原因可能是綠豆種皮較薄，對次氯酸較為敏感，因此消毒作用時間控制在10 min既能達到良好消毒效果又不會損傷綠豆活性。

植物離體組織培養體系中外植體消毒方式多種多樣，選擇合適種子消毒方式是獲得大量無菌外植體的基礎。消毒方式選用原則是獲得無菌效果且不影響愈傷組織的誘導。該研究通過比較各種消毒方式處理后的污染率、發芽率、出愈率及愈傷組織效果發現，75%乙醇+1.0% NaClO處理后的綠豆消毒效果好，發芽率與出愈率較高，愈傷組織效果較好。與75%乙醇+1.0% HgCl2消毒方式相比，有以下優勢：①對綠豆傷害小，保證高發芽率的同時愈傷組織誘導效果好;②易于采購，使用后的廢液對環境相對友好;③實驗人員操作安全，實驗室安全風險低。因此，在構建綠豆愈傷組織培養體系時，75%乙醇30 s+1.0% NaClO 10 min是一種較好的種子表面消毒方式。

參考文獻

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