微波輔助法提取潮州柑橘皮中總黃酮的工藝研究

劉志聰 鄭丹萍

摘要 [目的]優化微波輔助提取潮州柑橘皮中總黃酮的工藝。[方法]采取微波輔助提取法，以乙醇濃度、料液比、微波功率和微波時間為因素，利用4因素3個水平正交試驗，以總黃酮提取率作為評價指標，篩選最佳提取工藝。[結果]影響潮州柑橘皮中黃酮提取率的因素依次為微波功率、微波時間、料液比和乙醇濃度，最佳提取工藝條件為45%乙醇濃度，料液比1∶30（g∶mL），微波時間60 s，微波功率640 W，在該工藝條件下柑橘皮中總黃酮提取率可達1.173%。[結論]該研究可為潮州柑橘皮黃酮類化合物的開發利用提供科學依據。

關鍵詞 潮州柑橘皮;微波輔助提取;總黃酮;正交試驗

中圖分類號 TS 209? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）23-0188-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.053

Study on Microwave-assisted Extration of Total Flavonoids from Chaozhou Citrus Peel

LIU Zhi-cong， ZHENG Dan-ping

（School of Life Sciences and Food Engineering， Hanshan Normoal Universiy，Chaozhou， Guangdong 521000）

Abstract [Objective]To optimize the microwave-assisted extraction of flavonoids from Chaozhou citrus peel. [Method]Microwave assisted extraction was used to screen the best extraction process by taking ethanol concentration， solid-liquid ratio， microwave power and microwave time as factors， using 4 factors and 3 levels orthogonal test， and taking the extraction rate of total flavonoids as the evaluation index. [Result]The main factors affecting the extraction rate of flavonoids from Chaozhou citrus peel were microwave power， microwave time， solid-liquid ratio and ethanol concentration. The optimum extraction conditions were 45% ethanol concentration， solid-liquid ratio 1∶30 （g∶mL）， microwave time 60 s and microwave 640 W. Under these conditions， the extraction rate of flavonoids from citrus peel could reach 1.173%. [Conclusion]This study can provide a scientific basis for the development and utilization of flavonoids in Chaozhou citrus peel.

Key words Chaozhou citrus peel;Microwave-assisted extraction;Total flavonoids;Orthogonal test

基金項目 廣東省粵東藥食資源功能物質與治未病研究重點實驗室（2021B1212040015）。

作者簡介 劉志聰（1983—），男，廣東興寧人，實驗師，碩士，從事天然活性產物研究。

收稿日期 2021-03-17;修回日期 2021-04-27

柑橘皮醫學上稱為陳皮，為蕓香科植物柑橘成熟果實的果皮，在我國有悠久的藥用歷史。我國古代醫學認為，柑橘皮性味辛、微溫、無毒、入脾、肺經，有理氣調中、燥濕消痰、行氣導滯的功效，具有消炎、抗潰瘍、抑菌及利膽等作用[1]。柑橘皮所含營養成分除氨基酸外，其余成分含量均高于果肉，特別是果皮中富含橙皮苷、新橙皮苷、橘皮素、川陳皮素、二晴川陳皮等黃酮類化合物[2]。黃酮類化合物（Flavonoids）在植物中廣泛存在，是植物經光合作用產生的一大類次生代謝產物，作為一種功能成分，具有抗腫瘤、延緩衰老、增強心血管功能、增強免疫力、調解內分泌系統、護肝、抗炎、抗過敏、抑菌、抗病毒等功效[3]。近年來，國內外對黃酮類化合物的提取工藝優化及功能活性分析進行了大量研究[4-14]。柑橘皮中同樣含有多種黃酮類化合物，對柑橘皮藥理作用的廣泛深入研究和臨床試驗[2，15-16]證實，黃酮類化合物起著非常重要的作用。

潮州柑在潮汕地區栽培歷史悠久，至今已有1 300余年的歷史，是潮汕地區著名水果品種之一，也是潮汕地區老百姓比較喜愛的水果之一，每年會產生大量的果皮資源待利用。近年來，從柑橘皮中提取香精油、果膠和類胡蘿卜素等，已取得一定的研究成果，但尚未形成規模化生產。目前，柑橘皮除少量用于中藥和食品加工外，大部分柑橘皮被作為垃圾丟棄[15]。微波輔助提取技術具有耗能低、效率高、不破壞有效成分等優點。該研究通過優化微波輔助提取潮州柑橘皮中黃酮的工藝，為潮州柑橘皮中黃酮類化合物的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

市售新鮮的潮州柑橘洗凈取皮，在烘箱中（50 ℃）鼓風干燥，將干燥后的柑橘皮經粉碎機粉碎，過60目，備用。

1.2 主要試劑

蘆丁標準品（中國生物制品檢定所），95%乙醇、水、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁，均為國產分析純。

1.3 主要儀器

電熱鼓風干燥箱（上海市實驗儀器總廠），手提式粉碎機，JA3003N電子天平（上海精密科學儀器有限公司），WD800G型微波爐（格蘭仕微波爐電器有限公司），800型離心機（上海手術器械廠），WFJ7200型可見分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 微波輔助提取柑橘皮總黃酮工藝流程（圖1）。

1.4.2 蘆丁標準曲線的繪制[16]。

精密稱取經105 ℃干燥至恒重的蘆丁標準試劑0.011 g，用60%（V/V）乙醇溶解，并定量轉入100 mL容量瓶，用60%乙醇定容，搖勻配置成濃度為0.11 mg/mL標準母液。準確吸取0.11 mg/mL蘆丁標準母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于5只25 mL容量瓶中，加入15 mL 60%乙醇。然后加入0.3 mL 5%NaNO2，搖勻靜置6 min，再加入0.3 mL 10% Al（NO）3，搖勻靜置6 min后加入2.0 mL 1 mol/L NaOH，用60%乙醇定容至刻度線，搖勻靜置12 min。以60%乙醇作為空白對照，在500 nm處測定其吸光度3次，取平均值。以蘆丁濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線（圖2），建立回歸方程：y=11.071 0x+0.000 7，相關系數R2=0.999 7，具有較好的線性。

1.4.3 樣品中黃酮含量的測定。

取樣品溶液1.0 mL于25 mL容量瓶中，加入15 mL 60%乙醇，分別加入0.3 mL 5%NaNO2，搖勻靜置6 min，加入0.3 mL 10% Al（NO）3，搖勻靜置6 min后加入2.0 mL 1 mol/L NaOH，最后用60%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min。以60%乙醇作為空白對照，在500 nm處測定吸光度，平行試驗3次，吸光度取平均值，根據回歸方程計算樣品溶液的濃度及總黃酮含量。

總黃酮含量=C×F×V/m×100%

式中，C為樣品中黃酮濃度，mg/mL;F為溶液稀釋倍數;V為溶液體積，mL;m為樣品質量，mg。

1.4.4 微波提取工藝優化。

1.4.4.1 單因素試驗。

根據預試驗可知，影響柑橘皮總黃酮含量提取的因素為乙醇濃度、料液比、微波功率及微波時間，為獲得最高的提取率，進行以下單因素試驗：

（1）乙醇濃度：準確稱取1 g柑橘皮粉末，在料液比1∶10，微波功率320 W，微波時間40 s的條件下，分別設置體積分數為35%、45%、55%、65%、75%的乙醇進行試驗。

（2）料液比：準確稱取1 g柑橘皮粉末，在體積分數為55%乙醇，微波功率320 W，微波時間40 s的條件下，分別選擇料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50進行試驗。

（3）微波功率：準確稱取1 g柑橘皮粉末，在體積分數為55%乙醇，料液比1∶20，微波時間40 s的條件下，分別設定微波功率為0、160、320、480、640 W進行試驗。

（4）微波時間：準確稱取1 g柑橘皮粉末，在體積分數為55%乙醇，料液比1∶20，微波功率480 W的條件下，分別設定微波時間為20、30、40、50、60 s進行試驗。

1.4.4.2 正交試驗。

根據單因素試驗結果，以乙醇濃度、料液比、微波時間、微波功率設計4因素3水平（L9（34））正交試驗（表1）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對柑橘皮中總黃酮提取率的影響。

由圖3可知，隨著乙醇濃度的升高，柑橘皮總黃酮的提取率也隨之增大，在乙醇濃度在55%時可達到最大值，繼續升高乙醇濃度，柑橘皮總黃酮提取率反而下降。這可能與微波加熱的機理有關，因為提高乙醇濃度可以增大提取劑對樣品的滲透性，也可提高黃酮類化合物的溶解度，從而提高柑橘皮總黃酮的提取率，而在使用微波加熱時，樣品中的極性分子尤其是水分子吸收微波能會產生大量熱量使樣品升溫，乙醇濃度增大的同時就減小了料液中水的比例，使樣品升溫減慢從而影響柑橘皮黃酮的提取率。此外，柑橘皮中的黃酮類化合物含有易溶于水的黃酮苷和易溶于有機溶劑的黃酮苷元，且黃酮苷的含量高于黃酮苷元。當乙醇濃度低時，隨著乙醇濃度的升高，黃酮苷元溶解增加，黃酮的提取率逐步增大，但當乙醇濃度超過55%，隨著乙醇濃度升高，易溶于水的黃酮苷溶解減少，導致總黃酮的提取率下降。因此，乙醇的最佳濃度初步定為55%。

2.1.2 料液比對柑橘皮中總黃酮提取率的影響。

由圖4可知，隨著料液比的增大，柑橘皮總黃酮的提取率逐步提高，當料液比達到1∶20時，總黃酮的提取率最大，繼續增加溶劑量，提取率反而下降。究其原因可能是在料液比小于1∶20時，溶劑量過少導致柑橘皮中黃酮類化合物不能完全被提取;但料液比達到1∶20時，柑橘皮中黃酮類化合物被完全提取，因此黃酮提取率此時為最高;繼續增大料液比，由于溶劑量過多而使黃酮類化合物提取率下降。這可能由于當料液比大于1∶20時，提取劑對微波能的吸收增加，溫度升高減慢，導致細胞液對微波能吸收減少，細胞破裂不完全，柑橘皮中黃酮類化合物難以充分溶出。因此，提取的最佳料液比初步定為1∶20。

2.1.3 微波功率對柑橘皮中總黃酮提取率的影響。

由圖5可知，柑橘皮總黃酮的提取率隨微波功率的增大而提高，在320～480 W時提高尤為明顯;當微波功率大于480 W時，柑橘皮總黃酮提取率反而下降。這可能是由于微波輻射使細胞內部溫度升高，壓力增大，細胞壁破裂，化合物從細胞中釋放出來。一定時間范圍內，輻射功率越高細胞破碎越完全，柑橘皮中總黃酮的提取率越高;但微波功率過高，會導致黃酮類化合物的活性成分被破壞，發生變性或者降解，從而導致柑橘皮中總黃酮的提取率降低。因此，提取的最佳微波功率初步定為480 W。

2.1.4 微波時間對柑橘皮中總黃酮提取率的影響。

由圖6可知，當微波提取時間為20～50 s，柑橘皮總黃酮的提取率隨著微波時間的延長而迅速提高，但持續延長微波提取時間，總黃酮提取率反而下降。這很大程度是由于柑橘皮中黃酮類物質的溶出需要一定時間，當時間小于50 s時，由于時間短，細胞壁尚未完全破裂，總黃酮的提取率隨時間的增加而提高，而當時間大于50 s，總黃酮部分被分解或變性，有效成分減少，同時長時間的微波會導致乙醇揮發速度加快，從而使總黃酮的提取率降低。因此，提取的最佳微波時間初步確定為50 s。

2.2 正交試驗結果

根據上述單因素試驗結果，選擇乙醇濃度（45%、55%、65%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30）、微波功率（320、480、640 W）、微波時間（40、50、60 s）4個因素作為變量進行L9（34）正交試驗（表1）。以柑橘皮中總黃酮的提取率為考察指標，進一步優化柑橘皮中黃酮類化合物的提取條件。用SPSS 11.5軟件進行正交試驗數據分析，結果見表2。由表2可知，在4個影響因素中，對柑橘皮中黃酮類化合物提取率的影響從大到小依次為微波功率、微波時間、料液比、乙醇濃度。

采用正交助手軟件對正交試驗結果進行方差分析，并對影響因素繪制了效應曲線，結果見表3、圖7。

由表3的方差分析結果表明，微波功率對柑橘皮總黃酮提取的影響達到顯著水平，而乙醇濃度、料液比、微波時間均對柑橘皮總黃酮提取無顯著影響。

由圖7的效應曲線可以看出，乙醇濃度、料液比、微波功率、微波時間4個因素對柑橘皮總黃酮提取率的影響效果變化趨勢不同，但都出現明顯的拐點。

綜上所述，由表2可知，以總黃酮提取率為指標，正交試驗的最佳組合為A1B3C3D3，即乙醇濃度為45%，料液比為1∶30，微波功率為640 W，微波時間為60 s。

2.3 驗證試驗

在正交試驗最佳組合提取工藝條件下進行5次平行驗證試驗，準確稱取1 g柑橘皮粉末，以45%乙醇，料液比1∶30，微波功率640 W，微波時間60 s進行微波提取，測定結果見表4。由表4可知，在最佳組合工藝提取條件下，5次驗證試驗結果接近，潮州柑橘皮總黃酮的平均提取率為1.173%，相對平均偏差為0.382%，說明微波輔助法提取潮州柑橘皮中黃酮的優化工藝穩定可靠。

3 結論

該研究通過單因素試驗分別考察了乙醇濃度、料液比、微波功率和微波時間對潮州柑橘皮中總黃酮提取效果的影響，并通過正交試驗（L9（34）），以總黃酮提取率為考察指標，優化潮州柑橘皮中總黃酮的最佳提取工藝條件，即乙醇濃度為45%，料液比為1∶30，微波功率為640 W，微波時間為60 s，在該工藝條件下潮州柑橘皮中黃酮平均提取率為1.173%。

通過數據軟件分得出考4種因素的影響從大到小為微波功率、微波時間、料液比、乙醇濃度，即最重要的影響因素為微波功率，其次為微波時間，說明微波對潮州柑橘皮中黃酮類化合物的提取有較為明顯的促進作用。通過試驗表明，潮州柑橘皮中含有豐富的黃酮類化合物，能為今后潮州柑橘皮中黃酮的開發利用提供一定的理論依據。

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