主要促進(jìn)因子超家族成員MFSD2A對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

安松林 馬 玲 趙 月 李 雁*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤外科，北京 100038; 2. 北京電力醫(yī)院普通外科，北京 100073)

主要促進(jìn)因子超家族蛋白2A(major facilitator superfamily domain containing 2A，MFSD2A)是一種膜蛋白，于2008年被Angers確認(rèn)為主要促進(jìn)因子超家族(major facilitator superfamily，MFS)的新成員[1]。MFSD2A在胚胎發(fā)育、脂代謝、炎癥、再生和血-腦脊液屏障中均具有重要作用[2]。腫瘤相關(guān)的研究[3]顯示，MFSD2A在肺癌中發(fā)揮抑癌基因的功能，但MFSD2A在肝細(xì)胞肝癌中的研究尚未見報(bào)道。本研究通過構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，干擾MFSD2A在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，探索其對細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721從美國模式培養(yǎng)集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)購得。

1.1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司，Plv-EGFP載體購自中國賽亞生物科技有限公司，感受態(tài)細(xì)胞Stbl3和切膠回收試劑盒購自中國康為世紀(jì)生物科技有限公司，限制性內(nèi)切和T4 DNA連接酶和SYBR Premix Ex Taq購自日本Takara公司；單克隆片段重組酶試劑盒購自中國南京諾唯贊生物科技有限公司，抗-MFSD2A抗體(ab105399)購自英國Abcam公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本Dojindo公司，PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I購自美國BD Pharmingen公司，Transwell小室及Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721均由DMEM培養(yǎng)液混合10%(體積分?jǐn)?shù))FBS，100 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL青霉素在37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)MFSD2A的肝癌細(xì)胞株

根據(jù)MFSD2A基因[美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI) Reference Sequence: NM_001136493.2]序列分析的結(jié)果及質(zhì)粒上基因的插入位點(diǎn)，分別進(jìn)行DNA的設(shè)計(jì)及合成；線性化Plv-EGFP載體；切膠回收線性化載體并檢測濃度；通過同源重組的方式將合成的DNA片段連接到線性化載體上；提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證重組克隆中插入序列是否與要求一致。按照預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定最佳的感染條件和感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，對肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過qPCR和Western blotting檢測MFSD2A的上調(diào)效果。

1.2.3 構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)MFSD2A的細(xì)胞株

根據(jù)靶基因MFSD2A設(shè)計(jì)3條shRNA，選取的靶位點(diǎn)如下：5′AGCCGGAACGTGTCAAGTTTACTCGAGTAAACTTGACACGTTCCGGCT-3，5′-ATCATGCTCTCGGCCA- CTTTACTCGAGTAAAGTGGCCGAGAGCATGAT-3，5′-CCAT- GCTGCCTGATGTCATTGCTCGAGCAATGACATC-AGGCAGCATGG-3′；根據(jù)載體上靶基因插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成shRNA Oligos，通過退火的方式合成雙鏈DNA；提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證重組克隆中插入序列是否與要求一致。按照預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳的感染條件和MOI，對肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過qPCR和Western blotting檢測MFSD2A的下調(diào)效果。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

收集處于對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后HepG2和SMMC-7721細(xì)胞，三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-ethylenediaminetetraacetic acid,Tris-EDTA)緩沖液消化后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，制作濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，在96孔板中接種細(xì)胞懸液，每孔100 μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板置入37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于6、12、24、36、48、72 h后收集細(xì)胞，吸去舊培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避免產(chǎn)生氣泡影響度數(shù)；繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h顯色(預(yù)實(shí)驗(yàn)證明孵育1.5 h顯色效果最佳)；酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處的吸光度。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集處于對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后HepG2和SMMC-7721細(xì)胞，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細(xì)胞，PBS清洗兩次；加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL的Annexin V-APC，輕柔吹打混勻，加入5 μL的PI染液，輕柔吹打混勻；室溫條件下，避光孵育15 min；在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

在冰上將Matrigel基質(zhì)膠稀釋為300 μg/mL的工作液，加入Transwell小室的上室面，每孔100 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置1 h使基質(zhì)膠凝固，凝固后小心棄去上層培養(yǎng)基，制成包被基底膜的Transwell小室；為處于對數(shù)生長期的細(xì)胞更換無血清培養(yǎng)基，饑餓12 h以去除血清對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；消化、重懸得到濃度為5×105/mL的細(xì)胞懸液，取200 μL加入Transwell小室的上室，500 μL含10%(體積分?jǐn)?shù)) FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基加入下室；在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后用棉簽小心擦去上室內(nèi)的基質(zhì)膠及未穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞，PBS清洗小室2遍，用預(yù)冷甲醇固定30 min；風(fēng)干小室，用0.1%(體積分?jǐn)?shù))的結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗3遍，將小室底膜固定于載玻片上；倒置顯微鏡下觀察，每張選取10個(gè)視野拍照，統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞的數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)MFSD2A的肝癌細(xì)胞株構(gòu)建

通過轉(zhuǎn)染慢病毒載體后成功構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)及低表達(dá)MFSD2A的細(xì)胞株HepG2及SMMC-7721(圖1A)，使用qPCR(圖1B)及Western blotting(圖1C及1D)對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，MFSD2A的轉(zhuǎn)染效率均符合預(yù)期。

圖1 成功構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)和穩(wěn)定低表達(dá)MFSD2A的肝癌細(xì)胞株Fig.1 The stable high expression and low expression of MFSD2A were successfully constructedA: The expression of MFSD2A was observed by fluorescence microscope; Scale bar=200 μm. B: The mRNA expression of MFSD2A was detected by qPCR; C: The protein expression of MFSD2A was detected by qPCR; D: Western blotting. *P<0.05, **P<0.01, n=3; MFSD2A: major facilitator superfamily domain containing 2A.

2.2 MFSD2A對肝癌細(xì)胞增殖的影響

運(yùn)用CCK-8法分別于12、24、36、48和72 h對轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，上調(diào)MFSD2A表達(dá)可抑制HepG2(圖2A)和SMMC-7721(圖2B)細(xì)胞的活力，細(xì)胞增殖速率明顯下降(P<0.05)，而下調(diào)MFSD2A表達(dá)對HepG2和SMMC-7721的細(xì)胞增殖無明顯影響(P>0.05)(圖2A、2B)。

圖2 CCK-8法繪制轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的生長曲線變化Fig.2 CCK-8 method was used to draw the growth curve of hepatocellular carcinoma cell lines after transfectionA: The growth curve of HepG2 cells after differential expression of MFSD2A; B: The growth curve of SMMC-7721 cells after differential expression of MFSD2A. *P<0.05, **P<0.01 vs NC group, n=3; MFSD2A: major facilitator superfamily domain containing 2A; NC: normal control.

2.3 MFSD2A對肝癌細(xì)胞凋亡的影響

運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，上調(diào)MFSD2A表達(dá)的HepG2(圖3A)和SMMC-7721細(xì)胞(圖3B)的基礎(chǔ)凋亡率明顯升高；而下調(diào)MFSD2A表達(dá)的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的基礎(chǔ)凋亡率均有明顯下降(P<0.05)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡變化Fig.3 Flow cytometry was used to detect the apoptosis of hepatocellular carcinoma cell lines after transfectionA: The changes of apoptosis and the comparison of basic apoptosis rate of HepG2 cells after differential expression of MFSD2A; B: The changes of apoptosis of SMMC-7721 cells after MFSD2A differential expression. *P<0.05, **P<0.01 vs NC group, n=3; MFSD2A: major facilitator superfamily domain containing 2A; NC: normal control.

2.4 MFSD2A對肝癌細(xì)胞侵襲的影響

運(yùn)用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞侵襲能力進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，下調(diào)MFSD2A表達(dá)的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)顯著增多，細(xì)胞侵襲能力升高；上調(diào)MFSD2A表達(dá)的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)顯著減少，細(xì)胞侵襲能力降低(P<0.05)(圖4)。

圖4 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的侵襲能力變化Fig.4 Transwell chamber invasion assay was used to detect the invasion ability of transfected hepatocellular carcinoma cell linesA: Cell crystal violet staining through the matrix gel of Transwell chamber(100×); B: Comparison of the number of cells penetrating the matrix gel of Transwell chamber; *P<0.05, **P<0.01 vs NC group, n=3; MFSD2A: major facilitator superfamily domain containing 2A; NC: normal control.

3 討論

2008年，MFSD2A被確認(rèn)為膜蛋白促進(jìn)調(diào)解蛋白超家族的新成員，其定位于細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細(xì)胞質(zhì)，在腦、小腸、肝、腎、肺、乳腺、前列腺、胎盤以及棕色脂肪組織內(nèi)含量豐富[1, 4]。MFSD2A與體質(zhì)量增長、運(yùn)動機(jī)能和棕色脂肪產(chǎn)熱過程相關(guān)[5]。研究[6]顯示，MFSD2A在血-腦脊液屏障的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，是調(diào)控血-腦脊液屏障發(fā)育和功能的關(guān)鍵因子，具有抑制水泡樣胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，將MFSD2A基因敲除，水泡樣胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用增強(qiáng)，導(dǎo)致從胚胎到成年所有階段的血-腦脊液屏障破壞。MFSD2A還是ω-3脂肪酸二十二碳六烯酸(omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid，DHA)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是胎兒大腦和成年人大腦攝取DHA的主要途徑[7]。

根據(jù)目前的文獻(xiàn)[3,8-9]報(bào)道，MFSD2A在腫瘤中可能扮演著抑癌基因的角色。Spinola所在的研究團(tuán)隊(duì)[8]對MFSD2A在肺癌中的表達(dá)和功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)1個(gè)106 kb連鎖不平衡(1inkage disequilibrium，LD)區(qū)域含有與肺腺癌生存緊密相關(guān)的遺傳組件，這個(gè)區(qū)域位于1號染色體p34區(qū)，其中包含MFSD2A基因[8]；在肺腺癌和非小細(xì)胞肺癌檢測了MFSD2A的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)癌組織較癌旁正常組織中MFSD2A的mRNA水平下調(diào)了80倍[9]；體外研究[3]顯示，在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)MFSD2A，可導(dǎo)致G1期阻斷與S期DNA合成減少、細(xì)胞黏附與體外遷移受阻；用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和去甲基化試劑處理MFSD2A過表達(dá)的細(xì)胞后，MFSD2A的表達(dá)得以恢復(fù)，表明甲基化在MFSD2A表達(dá)抑制中具有一定作用，但其具體機(jī)制仍不明確。本研究顯示在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)MFSD2A，細(xì)胞黏附與體外遷移受阻，誘導(dǎo)凋亡，與上述研究結(jié)果相似。

中國人群的一項(xiàng)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)分析[10]顯示，MFSD2A rs4233508 T>C CC基因型可增加年輕胃癌以及中高分化腸型胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。通過免疫組化方法研究MFSD2A的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MFSD2A在胃癌組織中表達(dá)低于癌旁正常組織；MFSD2A陰性胃癌組織的微血管密度高于MFSD2A陽性者；MFSD2A在中高分化胃癌組織中的表達(dá)水平高于低分化胃癌，在早期胃癌組織中的表達(dá)高于進(jìn)展期胃癌；以上結(jié)果提示，MFSD2A可能影響腫瘤血管生成，抑制胃癌的發(fā)生和進(jìn)展[11]。細(xì)胞黏附介導(dǎo)的耐藥性是血液系統(tǒng)惡性腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)的機(jī)制之一，Arvidsson等[12]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MFSD2A可能在套細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病中參與了細(xì)胞黏附介導(dǎo)的微環(huán)境信號傳遞過程。

Pu等[13]發(fā)現(xiàn)MFSD2A在肝損傷和再生過程中發(fā)揮了重要作用，MFSD2A表達(dá)陽性的細(xì)胞群在肝臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)中減少，肝部分切除誘導(dǎo)的肝臟再生能顯著刺激門靜脈周圍MFSD2A陽性肝細(xì)胞的擴(kuò)增；在慢性肝損傷中，MFSD2A陽性的肝細(xì)胞群體明顯擴(kuò)張；而研究[14-18]顯示，80%以上的肝細(xì)胞肝癌是在慢性肝損傷的基礎(chǔ)上發(fā)生的。因此，MFSD2A促進(jìn)慢性肝損傷修復(fù)，可能延緩了慢性肝損傷發(fā)展為肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)程。

Xing等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MFSD2A在肝癌組織中表達(dá)低于正常組織；肝癌患者M(jìn)FSD2A血漿濃度低于健康人；MFSD2A表達(dá)水平較低的肝癌患者預(yù)后較差；多因素分析顯示,MFSD2A是肝癌患者預(yù)后差的獨(dú)立預(yù)后因素(P=0.027)。

本研究顯示，在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)MFSD2A，可顯著抑制細(xì)胞活力，誘導(dǎo)基礎(chǔ)凋亡，并在一定程度上導(dǎo)致細(xì)胞黏附與體外遷移受阻；而下調(diào)MFSD2A則導(dǎo)致相反的促腫瘤效應(yīng)。與上述研究結(jié)果相似，MFSD2A在肝癌的腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮抑癌基因的保護(hù)性功能，其異常下調(diào)可促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，但其具體機(jī)制仍待后續(xù)深入研究。