B淋巴細胞瘤-xL蛋白及其在腫瘤耐藥中作用機制的研究進展〔1〕

楊偉鋒，李曉寧，李軍岐，許書君，王菁婧，張晨靜

(1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學，山西 太原 030001)

臨床上治療腫瘤的三種手段是手術、放療和化療，只有化療是全身治療手段，但耐藥性極大地影響了化療藥物的療效。研究[1]顯示，B淋巴細胞瘤-XL蛋白(Bcl-xL)是腫瘤耐藥機制中的一個重要靶點，尤其是它在腫瘤細胞中的過表達與腫瘤耐藥密切相關，且在結直腸癌、膀胱癌、白血病、卵巢癌及宮頸癌等腫瘤中都得到證實。因此認識Bcl-xL蛋白并探究其在腫瘤耐藥中的作用機制對未來腫瘤研究的發(fā)展至關重要。本文就目前Bcl-xL蛋白的研究進展，從其分子結構、生物功能、調節(jié)機制以及在腫瘤耐藥中的作用機制等方面進行闡述，為今后腫瘤耐藥機制的研究提供理論基礎。

1 B淋巴細胞瘤-XL蛋白

1.1 Bcl-xL蛋白的結構

B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)家族蛋白是調控細胞凋亡的重要蛋白。1984年Bcl-2基因在人類的B細胞淋巴瘤細胞異位染色體t(14，18)上首次克隆產生，從此打開Bcl-2家族蛋白的探索之門。截至目前，已經發(fā)現(xiàn)了25種Bcl-2同源蛋白。根據(jù)其結構和功能主要分為三類：第一類具有抗凋亡的作用，包括Bcl-2，Bcl-w，Bcl-xL等；第二類具有促凋亡作用，包括Bax，Bak等；第三類只有BH3結構域，稱為BH3-only，同樣具有促進細胞凋亡的作用。Bcl-xL是Bcl-2家族中第一個闡明空間結構域的蛋白，它是利用X射線晶體衍射與核磁共振分光術相結合的方式獲得的，促進了Bcl-2家族中其他蛋白結構的研究。Bcl-xL是一種由233個氨基酸組成的蛋白質，其所包含的結構域與Bcl-2相似。它是由一條長度可變的環(huán)形結構連接8個α螺旋構成，含有與Bcl-2同源的結構域—BH1，BH2，BH3和BH4，其中BH4，BH3結構域分別與α螺旋1、α螺旋2相對應，BH1結構域與α螺旋5以及與其相連的環(huán)形結構相對應，BH2與α螺旋6及其下游的結構域相對應。在Bcl-xL蛋白中有一個疏水環(huán)，它的頂部由BH1，BH2，BH3三個結構域構成，底部由α螺旋3和α螺旋4構成。這個疏水環(huán)可以與Bcl-2家族中部分促凋亡蛋白上相應的結構結合形成一個異源二聚體，從而發(fā)揮Bcl-xL的抗凋亡作用[1]。正常情況下，合成的Bcl-xL散布在胞質中，只有接受細胞凋亡信號時，它才會迅速轉移到線粒體膜表面發(fā)揮作用。Bcl-xL作為細胞中抗凋亡的主要作用因子，還有其他重要作用，例如在對成年小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL蛋白對輻射引起的腎臟損害所致的貧血具有保護作用[2]；其次還發(fā)現(xiàn)Bcl-xL蛋白可通過對神經生長和突觸可塑性的調節(jié)、對Ca2+信號傳遞的調節(jié)來促進ATP合成和提高代謝效率；另外其在自身免疫性疾病與衰老過程中也發(fā)揮重要作用[3]。

1.2 Bcl-xL蛋白的功能及其調控機制

Bcl-xL最主要的作用為抑制細胞凋亡，其在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。細胞凋亡是指機體為維持內環(huán)境的穩(wěn)定而通過一系列基因調控細胞死亡的過程。細胞凋亡主要有三種途徑，分別是死亡受體凋亡途徑、線粒體途徑以及內質網途徑。Bcl-xL主要通過線粒體途徑發(fā)揮其抗凋亡作用。在線粒體凋亡途徑中，當接收到細胞凋亡信號時，線粒體在各種因子作用下發(fā)生線粒體膜通透性改變，使線粒體轉運孔開放、跨膜電位降低，引起凋亡啟動因子細胞色素c和凋亡誘導因子釋放，激活半胱氨酸蛋白酶級聯(lián)反應，使DNA分子斷裂產生凋亡小體，最終導致細胞凋亡。在這一個過程中Bcl-xL蛋白迅速聚集到線粒體外膜，通過疏水環(huán)與促凋亡蛋白Bax的BH3結構域之間的特異性結合來抑制線粒體外膜通透性改變，從而阻止線粒體凋亡途徑的進行，進而發(fā)揮抗凋亡作用[5]。由此可見，調控細胞凋亡的關鍵點在于Bcl-xL蛋白的產生。目前已知Bcl-xL蛋白是人類第20號染色體上的Bcl-xL基因通過選擇性剪接產生的蛋白質。細胞凋亡在轉錄水平的調節(jié)，主要是通過一系列的轉錄因子對Bcl-xL基因表達進行調控，從而影響B(tài)cl-xL蛋白的產生。研究[6]顯示，在人的成骨細胞中表達一種轉錄因子即GATA-DNA結合蛋白(GTA-3)，可以調節(jié)Bcl-xL基因表達的反式激活活性來影響骨折的愈合。在大腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA HEIH(lncRNA-HEIH)可以破壞miR-939與核因子κb(NF-κb)的結合，導致NF-κb與Bcl-xL啟動子的結合增加，最終促進Bcl-xL基因的轉錄和表達[7]。另外，研究[8]發(fā)現(xiàn)核轉錄因子(Nrf2)可以與細胞保護基因啟動子區(qū)的抗氧化反應元件(ARE)結合，增強其表達；過表達的Nrf2可以增強抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達，從而增強細胞的耐藥性[8]。

目前已知Bcl-xL蛋白的降解主要通過泛素化蛋白酶體系統(tǒng)來調節(jié)。在泛素化蛋白酶體系統(tǒng)中最重要的酶是E3泛素連接酶，它決定了泛素化對底物的選擇性和特異性[9]。跨膜泛素連接酶RNF-183是一個含有典型C3HC4環(huán)指結構的蛋白，在哺乳動物的細胞系中很常見。該蛋白主要定位在內質網的膜整合蛋白，具有E3泛素連接酶的活性，它可以多聚泛素化修飾Bcl-xL，促使Bcl-xL蛋白的降解[10]。在對結直腸癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，特異性激活蛋白酶活化受體2(PAR2)可以顯著上調Bcl-xL蛋白的表達，同時還發(fā)現(xiàn)Bcl-xL蛋白的半衰期延長。研究[11]表明，激活PAR2信號通路能夠增加促凋亡蛋白Bad的磷酸化，同時增加抗凋亡蛋白Mcl-1表達的磷酸化，而Bad與Mcl-1都屬于Bcl-2蛋白家族。所以在敲除結直腸癌細胞中PAR2基因后，我們發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶RNF152的表達顯著增加，同時發(fā)現(xiàn)過表達的RNF152可明顯降低Bcl-xL蛋白的表達水平。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)RNF152可以與Bcl-xL蛋白相互作用，且活化的PAR2可以降低RNF152與Bcl-xL蛋白之間的相互作用。由此表明，PAR2可能通過抑制Bcl-xL蛋白的泛素化降解而促進Bcl-xL蛋白在結直腸癌細胞中的高表達，證實在結直腸癌細胞中過表達的Bcl-xL蛋白可能受PAR2的調控，從而影響其耐藥性[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)維甲酸-干擾素誘導的死亡相關基因GRIM19在對順鉑產生耐藥性的晚期膀胱癌細胞中的過表達可以促進Bcl-xL蛋白的泛素化，并推斷該泛素化過程可能以P38/JNK依賴的方式進行，且已證實可以降低癌細胞中Bcl-xL蛋白的表達，降低膀胱癌細胞對順鉑的耐藥性。研究[14]發(fā)現(xiàn)跨膜E3泛素連接酶RNF183能以泛素化依賴的方式降解抗凋亡蛋白Bcl-xL。由此可見，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導的Bcl-xL蛋白的降解可能為Bcl-xL高表達導致的腫瘤耐藥提供了新的治療靶點。

此外，腫瘤抑制因子p73在胞漿中通過其反式激活結構域(TAD)與Bcl-xL中一個非經典位點結合，影響B(tài)cl-xL的修飾識別模式，從而誘導細胞以線粒體途徑凋亡[13]。

2 Bcl-xL與腫瘤耐藥

目前研究表明腫瘤化療失敗的主要原因是腫瘤耐藥[14]。腫瘤產生耐藥的原因多種多樣，包括耐藥相關蛋白的異常表達、DNA損傷和修復功能障礙、細胞自噬以及細胞的凋亡機制異常等[15]。化療藥物殺死腫瘤細胞的主要機制就是通過各種途徑誘導細胞凋亡。近年不斷有研究者發(fā)現(xiàn)[16]，抗凋亡蛋白Bcl-xL在多種耐藥腫瘤細胞中都有過表達的現(xiàn)象。在小細胞癌、膀胱癌、黑色素瘤以及急性髓系白細胞病(AML)，尤其是化療耐藥的AML中，都發(fā)現(xiàn)了抗凋亡蛋白Bcl-xL過表達的現(xiàn)象。研究[17]顯示通過人工調節(jié)Bcl-xL蛋白在膠質細胞瘤干細胞中的表達發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL蛋白的表達與腫瘤的大小具有相關性，此外通過上調Bcl-xL蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，膠質母細胞瘤對BH3模擬物敏感。對于過表達的Bcl-xL蛋白是如何影響腫瘤耐藥的?研究發(fā)現(xiàn)在不同的腫瘤中其作用機制也不相同。在惡性外周神經鞘瘤(MPNST)細胞研究中發(fā)現(xiàn)，NF1基因表達下調時，Bcl-xL蛋白高表達可導致細胞對抗癌藥物產生耐藥性，表明Bcl-xL蛋白的過表達與MPNST細胞的耐藥性產生相關[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)轉錄因子1 (WT1)與急性髓系白血病細胞系中Bcl-xL表達密切相關，可以直接與Bcl-xL基因的啟動子結合反式激活Bcl-xL基因表達，而Bcl-xL蛋白的過表達可以使AML細胞對抗癌藥物的耐藥性增加。王彩梅和李海香[20]研究宮頸癌細胞時發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL蛋白的表達水平隨miR-417的表達降低而降低。通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL蛋白在該類細胞中過表達可以逆轉由miR-417下調引起的細胞凋亡，使細胞對化療藥物產生耐藥性[20]。研究[21]顯示在尿路上皮癌細胞中，三氟拉嗪(一種抗精神藥物)可以通過抑制Bcl-xL蛋白的表達使其對順鉑的耐藥性降低，說明尿路上皮癌細胞的耐藥性與Bcl-xL蛋白的表達具有相關性。除此之外，我們課題組前期預實驗結果顯示，Bcl-xL蛋白的高表達與卵巢癌的耐藥性相關。綜上所述，不同腫瘤細胞對抗癌藥物產生耐藥性與Bcl-xL蛋白的過表達密切相關，但是其中具體的作用機制有待進一步研究。

3 Bcl-xL蛋白拮抗劑

雖然Bcl-xL蛋白在腫瘤耐藥中的具體作用機制還不是很明了，但不少研究者已將Bcl-xL蛋白作為腫瘤耐藥治療的突破口。研究表明，BH3結構域是Bcl-xL蛋白發(fā)揮抗凋亡功能的必要結構，因此針對BH3結構域設計與其具有較高親和力和選擇性的活性小分子已成為當下癌癥藥物研究的熱點[22]。目前對Bcl-xL蛋白拮抗劑分子骨架的研究較多，主要有以下三種：第一，由Ryan等[23]運用全新藥物設計方法研究的具有苯甲酰脲骨架的Bcl-xL拮抗劑，具有很強的靶向性；第二，Tao等[24]研究證明，含有苯丙噻唑骨架的Bcl-xL蛋白拮抗劑，對慢性淋巴細胞白血病和非霍奇金淋巴瘤有一定的療效；第三，以磺酰胺為核心骨架的Bcl-xL蛋白拮抗劑，是目前達到摩爾水平的小分子抑制劑。這三種分子骨架是目前Bcl-xL蛋白拮抗劑研究的三個不同方向，相信隨著研究的深入，將會開發(fā)出更多的Bcl-xL蛋白拮抗劑。

4 結 語

腫瘤耐藥是一個極其復雜的過程。Bcl-xL蛋白作為腫瘤耐藥機制中的一個重要靶點，深入研究其在腫瘤耐藥中的作用機制，對增強化療藥物的療效有很大的幫助。目前雖已進行了大量研究，但依舊處于質變前的量變積累階段，大多數(shù)對腫瘤耐藥中Bcl-xL蛋白作用機制的研究只是證明了某種影響因子與Bcl-xL蛋白之間存在相互作用，對于二者之間是如何相互作用的研究很少。因此，更加深入地研究各種影響因子與Bcl-xL蛋白之間的相互作用，闡明Bcl-xL蛋白的作用機制對解決腫瘤耐藥問題至關重要。