補腎活血方對宮腔粘連大鼠子宮內膜形態及胞飲突的影響

章曉樂，王敏燕，梁程程，楊夢琪，蔡靜雯，齊聰*

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院 1.婦產科；2.病理科，上海 201203)

宮腔粘連(Intrauterine adhesion，IUAs)多由于宮腔內手術操作不當或過度操作導致子宮內膜損傷而引起[1]，發病率呈逐年增高的趨勢[2]。子宮內膜損傷后體內相關炎性因子上調，誘導并促進在位子宮內膜干細胞分化，對子宮內膜的修復起到積極作用[3]。但若患者內膜損傷嚴重且存在感染等因素時，基底層完整性缺損，部分內膜缺血、對雌激素不應答，活性氧異常蓄積，導致內膜微環境發生相應改變，形成大量纖維組織繼而出現IUAs[4]，甚至于導致不孕癥發生。

從中醫角度研究，IUAs患者證候特點屬于月經量少、閉經、不孕癥的范疇。病機多為腎虛血瘀，而補腎活血方具有活血化瘀、補腎填精以生新之功效。前期有臨床研究發現，應用補腎活血方可改善IUAs分離術后的子宮內膜厚度，有效緩解反復移植失敗，提高臨床妊娠率[5]。故本研究采用機械損傷加感染的方法建立IUAs模型大鼠，從子宮內膜病理形態變化及胞飲突的影響，擬探討補腎活血方促進IUAs修復的作用。

材料與方法

一、實驗動物與分組

選取清潔級性成熟未孕雌性8～10周齡SD大鼠70只，每只大鼠體重約220～250 g，性周期4～5 d。實驗動物由上海中醫藥大學實驗動物中心提供[合格證編號20170005015466，許可證編號SCXK(滬)2017-0005]。本研究通過上海中醫藥大學實驗動物福利與倫理委員會審查(倫理編號PZSHUTCM190912003)。

實驗SD雌性大鼠進行適應性飼養后，按隨機數字表法分為4組：空白對照組及模型對照組各20只，補佳樂組和補腎活血組每組各15只。

二、藥物制備及劑量

1.補腎活血方：由上海中醫藥大學附屬曙光醫院門診中藥房配制，成分：鹿角片9 g、菟絲子15 g、巴戟天15 g、熟地黃12 g、黃芪30 g、當歸15 g、牛膝18 g、川芎9 g、水蛭15 g、炙甘草6 g。實驗劑量：補腎活血方人的臨床用藥劑量為18 g/d，根據“人和動物間體表面積折算的等效劑量比值表”[6]得出200 g大鼠與70 kg人折算系數為0.018，因此計算出大鼠補腎活血方的等臨床劑量為1.62 g/kg。將補腎活血方制成濃度為1.5 g/ml混懸液，保存于4℃冰箱，每日稱重大鼠體重，計算相應補腎活血方混懸液劑量進行灌胃。

2.補佳樂：補佳樂(戊酸雌二醇片)購自拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，國藥準字J20130009，規格1 mg/片。根據“人和動物間體表面積折算的等效劑量比值表”，人的臨床用藥劑量為2 mg/d，計算出大鼠補佳樂的等臨床劑量為0.18 mg/kg。使用前將補佳樂研磨成粉，用0.9%生理鹽水以0.18 mg：10 ml的比例制成混懸液，放置于4℃冰箱保存，每日稱重大鼠體重，計算相應補佳樂混懸液劑量進行灌胃。

三、實驗方法

1.造模方案：模型對照組、補佳樂組及補腎活血組均參照文獻[7]進行造模，建立子宮內膜腔雙重損傷模型(機械刮宮+細菌脂多糖感染)。對處于動情期的體重220 g左右雌性SD大鼠(動情期鑒定：大鼠陰道涂片顯微鏡下顯示片狀多角上皮細胞)給予10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，給藥劑量按照0.4 ml/100 g計算。麻醉后，將大鼠仰臥位固定于手術板上，備皮、消毒，距恥骨聯合上約1 cm下腹部正中切開，切口長約2.5 cm，逐層進入腹腔，暴露右側子宮角，于距離卵巢0.5 cm處，剪出長約3 mm平行于子宮長軸的切口，直徑2.5 mm微型刮匙，反復來回搔刮大鼠宮腔前后左右4個不同方向，子宮四壁有毛糙感時停止。將子宮角上的切口縫合，之后將直針(已穿好3號細菌脂多糖手術絲線)穿過右側宮腔，置留約2 cm長絲線于宮腔中，回納右側子宮腔；同樣方法進行左側宮腔操作。0.9%生理鹽水沖洗腹腔2次，之后逐層縫合腹壁及皮膚。

2.空白對照組大鼠處理：參考文獻[8]操作，麻醉、開腹操作同造模大鼠，宮角充分顯露于體外后回納，不采取其余操作，予0.9%生理鹽水沖洗腹腔2次，之后逐層縫合腹壁及皮膚逐層關腹。

所有大鼠蘇醒前均注意保溫以防術后體溫過低導致死亡，連續3 d予青霉素肌肉注射抗感染，用量為200 000 U/d。大鼠麻醉清醒后正常飼養，觀察其飲食和活動情況。

3.各組的干預方案：(1)空白對照組和模型對照組：手術完成1周后，使用蒸餾水灌胃，給予劑量按0.1 ml·kg-1·d-1計算，連續灌胃至取材，合籠雌鼠連續灌胃3個動情周期，每個周期5 d；(2)補佳樂組：模型制備1周后，按照前述藥物濃度根據大鼠體重給予補佳樂混懸液灌胃，灌胃持續時間同前；(3)補腎活血組：模型制備1周后，按照前述藥物濃度根據大鼠體重給予補腎活血方混懸液灌胃，灌胃持續時間同前。

4.取材：空白對照組及模型對照組造模7 d后頸椎脫臼法各處死5只大鼠，取材用以驗證造模效果。其余大鼠灌胃處理后第10天(造模后第17天)，頸椎脫臼法處死每組10只雌鼠，取材用于相關實驗。開腹操作同造模，剝離子宮角壁上的系膜，剪開輸卵管和子宮，獲取一角全部子宮標本。PBS緩沖液沖洗一角子宮標本后投入3%戊二醛中固定5 min，切分成0.5 cm×0.5 cm大小的6～7塊，浸泡于4%多聚甲醛液中固定備用。剩余對側一角子宮保存于液氮中以備后續試驗使用。

每組剩余5只雌鼠與雄鼠以2∶1的比例合籠，次日晨8∶00進行陰道涂片，觀察陰道脫落細胞了解受精情況，見陰栓者記為妊娠第1天。在妊娠第5天的19時從尾靜脈注射0.5%伊文思藍0.1 ml，15 min后用頸椎脫臼法處死大鼠，開腹，根據子宮的嗜色反應判斷著床部位(著床位點著色顯示藍色)，記錄各組妊娠鼠數和孕鼠著床點數。一角子宮縱向切開，留取部分子宮組織，避光保存于2.5%戊二醛中以備掃描電鏡觀察。

5.HE染色：取出固定1周后的子宮標本，進行石蠟包埋、切片、HE染色，脫水封片。在光鏡下觀察大鼠子宮內膜腺體、血管分布情況、腔上皮或腺上皮細胞形態學變化。子宮內膜厚度采用ImageJ圖像處理軟件測定。

低倍鏡(×10)下子宮內膜厚度測量的具體方法：測量子宮內膜肌層交界處至宮腔的垂直距離，每組取3張切片，每張切片隨機取4個視野，計算平均值。高倍鏡(×100)下計數腺體數目：通過HE染色，每組取3張切片，每個切片隨機取4個視野，觀察并計算子宮內膜腺體數量。

6.掃描電鏡觀察子宮內膜形態學變化：SD大鼠子宮樣本在2.5%戊二醛溶液中固定2～3 h(4℃)后，取出，用pH7.4 PBS沖洗3次(共3 min)，1%鋨酸固定3 h(4℃)。用0.1 mol/L PBS沖洗3次，每次沖洗5～10 min，再經梯度酒精脫水(酒精濃度依次為30%、50%、70%、90%、100%)、真空干燥、噴金。于上海中醫藥大學電鏡室進行掃描電子顯微鏡下觀察子宮內膜結構和胞飲突形態。

四、統計學分析

結 果

一、各組大鼠子宮內膜HE染色組織學觀察

各組大鼠子宮內膜HE染色鏡下特點各有不同(圖1)。空白對照組：大鼠子宮結構完整，從內至外分為：內膜層、肌層、漿膜層；宮腔面積大，內膜層分為上皮層和間質，上皮層為單層柱狀上皮細胞；內膜層血管及腺體豐富，子宮內膜均勻。模型對照組：與空白對照組相比，宮腔殘余面積減少，子宮內膜厚薄不均，整體變薄，子宮內膜間質細胞、腺體及血管明顯減少、稀疏、無活性，間質可見大量纖維組織增生，囊樣擴張。補腎活血組：較模型對照組宮腔殘余面積明顯增大，子宮內膜間質細胞、腺體及微血管增多，子宮內膜間質未見明顯炎性細胞浸潤，可見新生血管及呈簇狀存在的腺體。補佳樂組：同補腎活血組相似，可觀察到損傷的內膜恢復現象，宮腔殘余面積較模型對照組明顯增加，間質部出現較模型對照組多的腺體，部分毛細血管內見微小栓子。

表示腺體 ↓表示血管

二、各組大鼠子宮內膜厚度及腺體數量比較

各組內膜厚度數據服從正態分布，滿足方差齊性，統計學分析發現各組間內膜厚度比較有顯著性差異(F=16.49，P<0.01)。空白對照組內膜最厚，補腎活血組次之，再次為補佳樂組，模型對照組最薄。補腎活血組、補佳樂組的內膜厚度顯著大于模型對照組(P<0.05)，補腎活血組的內膜厚度顯著大于補佳樂組(P=0.02)(表1)。各組大鼠子宮內膜腺體數量組間比較亦有顯著性差異(F=26.75，P<0.01)，空白對照組最多，補腎活血組次之，模型對照組最少；補腎活血組腺體數量顯著高于補佳樂組(P=0.002)。

表1 各組大鼠內膜厚度比較

三、各組大鼠胚胎著床數比較

空白對照組、模型對照組、補腎活血組、補佳樂組每組進行合籠的5只大鼠均妊娠。各組大鼠著床數組間比較有顯著性差異(F=26.88，P<0.01)，空白對照組最高，補腎活血組次之，再次為補佳樂組，模型對照組最低(P<0.05)；補腎活血組著床數顯著高于補佳樂組(P<0.05)(表2)。

表2 治療后胚胎著床數比較

四、掃描電鏡觀察子宮內膜形態變化

各組大鼠電鏡下觀察到的內膜形態特點不同(圖2)。空白對照組：掃描電鏡下見明顯發育成熟的胞飲突，表面光滑，覆蓋微絨毛，長絨毛消失。模型對照組：掃描電鏡下見子宮內膜表面絨毛稀疏、破壞嚴重，部分絨毛見缺損，可見少量小胞飲突表達。補腎活血組：掃描電鏡下見胞飲突高度低于絨毛，胞飲突正在發育階段，僅見個別成熟胞飲突，絨毛較為光滑。補佳樂組：掃描電鏡下見胞飲突正在發育階段，未完全成熟，部分胞飲突發育不飽滿，發育程度差，絨毛結構不清晰，表面粗糙。

圖2 各組大鼠子宮內膜電鏡下掃描所見(×10 000)

討 論

本研究中使用的補腎活血方(又名宮腔I號方)是上海市名中醫齊聰教授治療子宮內膜損傷(如宮腔粘連等)導致不孕癥、月經量少的經驗方。補腎活血方的組成及功效為：鹿角片(9 g)為血肉有情之品，與菟絲子(15 g)、熟地黃(12 g)、巴戟天(15 g)聯用補腎填精；黃芪(30 g)補氣以助血行，水蛭(15 g)作為全方之引藥，其走竄之性，引藥入胞宮，與當歸(15 g)、牛膝(18 g)、川芎(9 g)聯用，補血活血，引血下行通絡；炙甘草(6 g)調和諸藥，全方陰陽并補、動靜結合，共奏補腎活血之功效。之前研究發現，應用補腎活血方結合IUAs分解手術，能明顯提高IUAs導致反復移植失敗患者的臨床妊娠率[5]。

本研究采用感染和機械刮宮雙重損傷建立動物模型，該造模方式與人類子宮內膜損傷過程相似。雙重損傷造模過程中發現，造模第7天子宮內膜完整性被破壞，間質纖維增多，粘連形成，導致宮腔失去正常形態，提示選用SD大鼠建立IUAs模型用于探索IUAs的發病機制是可行的，也再次驗證了之前文獻[6]的觀點。

感染和機械刮宮雙重損傷后，HE染色觀察發現，模型對照組中宮腔殘余面積減少，子宮內膜厚薄不均，整體變薄，子宮內膜間質細胞、腺體及血管減少明顯、稀疏、無活性，間質可見大量纖維組織增生，囊樣擴張。子宮內膜粘連的組織病理學特征通常是以無血管或血管薄壁、擴張的毛細血管為特征[9]。模型對照組宮腔形態改變符合IUAs的病理變化，提示該模型可以模擬IUAs疾病的臨床及病例特點。

合適的子宮內膜厚度能夠為胚胎的植入提供優良的“土壤”，是確保妊娠結局良好的關鍵條件。對子宮內膜的厚度進行評估，是衡量子宮內膜損傷后修復的重要指標[10]。對造模大鼠分別予以補腎活血方、補佳樂干預治療后，通過HE染色，對損傷后大鼠內膜厚度進行觀察，并與模型對照組進行比較，發現治療組子宮內膜厚度均有顯著增加的趨勢(P<0.05)，且補腎活血組內膜厚度顯著大于補佳樂組(P<0.05)。有研究認為，補腎活血方聯合西藥治療可以改善子宮內膜血流灌注情況，增加胚胎著床日內膜厚度[11]。廖慧慧等[12]研究發現，給予補腎中藥成分治療可上調損傷后子宮內膜血管內皮生長因子受體及孕激素受體的表達，促進損傷后子宮內膜組織對激素的應答，有利于子宮內膜增厚。本研究結果再次證實，宮腔操作手術后給予補腎活血中藥治療，因其補腎填精之功效，能調動子宮在位內膜增生，對子宮內膜損傷修復具有積極意義。

子宮內膜損傷后可導致內膜變薄，內膜腺體及間質出現萎縮，內膜逐漸瘢痕化。子宮內膜腺體數量可作為評價子宮內膜損傷后修復及再生的指標[13]。本研究對內膜基質層腺體數量進行觀察發現，模型對照組腺體數量明顯減少，補腎活血組與補佳樂組較模型對照組均顯著增加，且補腎活血組腺體數量增多顯著高于補佳樂組(P<0.05)，提示補腎活血方可有效促進損傷子宮內膜中的腺體數量恢復，可能有助于改善內膜微環境。

胞飲突是子宮內膜“種植窗”開放的重要標志物，是評估子宮內膜容受性的微觀標志物。胞飲突在分泌期時位于子宮內膜微絨毛細胞頂部，成熟的胞飲突電鏡下呈現表面光滑的蘑菇狀凸起。成熟的胞飲突可增加胚胎與內膜的接觸面積，促進其粘附及著床[14-15]。研究證實，妊娠第4天起大鼠子宮內膜中的胞飲突數量增加，第5天達到峰值，植入后期其數量呈下降趨勢[16]。本研究于妊娠第5天取材觀察大鼠內膜胞飲突狀態，發現模型對照組SD大鼠宮腔微絨毛結構紊亂稀疏，胞飲突發育緩慢；給予補腎活血方能使胞飲突附著部位的微絨毛結構相對完整，胞飲突飽滿，內膜突起表面光滑，接近于成熟；補佳樂組胞飲突結構也有所恢復，但絨毛結構相對不清晰，胞飲突發育程度差。提示補腎活血方能更好地促進胞飲突成熟和絨毛結構完整，改善子宮內膜容受性，有助于胚胎定位、黏附。后續研究中可以對胞飲突的數量進行量化比較，以進一步驗證補腎活血方改善子宮內膜容受性的療效。

本研究結果顯示，補腎活血組、補佳樂組與模型對照組相比，妊娠大鼠的著床數顯著增加，且補腎活血組著床數顯著高于補佳樂組(P<0.05)，但均不及空白對照組(P<0.05)。提示宮腔內膜損傷會降低內膜容受性，影響胚胎著床。給予補腎活血方和補佳樂治療均能一定程度改善大鼠受損子宮內膜的容受性，有利于受精卵植入及胚胎發育，且補腎活血方效果更佳，這可能與傳統補腎填精類中藥具有一定雌激素功效，可以提高雌激素受體水平，改善子宮內膜厚度及內膜容受性的作用有關[17]。同時活血化瘀類中藥能夠擴張血管，促進微循環，有利于損傷內膜的容受性恢復[18]。

綜上所述，本研究采用感染和機械刮宮雙重損傷成功建立動物模型，并探討造模后給予補腎活血方干預子宮內膜形態的改變。研究結果提示，補腎活血方能有效改善子宮內膜厚度，促進內膜中腺體數量恢復及胞飲突發育，有利于胚胎著床。后續研究可以檢測子宮內膜損傷后采用補腎活血方治療內膜中相關細胞因子、激素受體等指標的變化，以進一步探討補腎活血方促進子宮內膜修復的具體機制。