基于TCGA分析肝細(xì)胞癌組織miR-5003-3p表達(dá)變化及其與患者預(yù)后的關(guān)系

別蓓蓓，白宏 ，方歡樂，吳夢(mèng)迪

1 西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，西安710125；2 西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系

肝細(xì)胞癌（HCC）作為原發(fā)性肝癌的主要類型，是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，惡性程度高，為全球第四大致死性腫瘤，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅［1］。盡管HCC治療手段多樣，包括手術(shù)治療（肝切除、肝移植）、消融治療（射頻、微波）、放化療、介入治療、分子靶向治療、免疫治療等［2］；但由于HCC 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、早期病程隱匿、發(fā)病率高、預(yù)后差以及術(shù)后高復(fù)發(fā)與高轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，特別是缺乏有效的早期診斷方法，導(dǎo)致患者病死率居高不下，迫切需要尋找可用于HCC 早期診斷、預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物以及可應(yīng)用于治療的分子靶標(biāo)。微小RNA（miRNAs）是一類長(zhǎng)度為22～24個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，其可通過與靶基因的3′端非翻譯區(qū)（3′-UTR）不完全互補(bǔ)或完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯或者引起mRNA 降解，是轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的重要分子之一［3］。大約50%的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)區(qū)，提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。研究表明，miRNAs參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等，其作為腫瘤生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有巨大潛力［4-6］。近期研究發(fā)現(xiàn)了一條轉(zhuǎn)錄于人類5號(hào)染色體的miR-5003-3p，其在胃癌、乳腺癌組織中均異常高表達(dá)，可通過促進(jìn)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）參與腫瘤發(fā)生發(fā)展［7-8］。2021 年 3 月—6 月，本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)觀察miR-5003-3p 在HCC 組織中的表達(dá)情況，并分析其與患者預(yù)后的關(guān)系，為miR-5003-3p應(yīng)用于HCC的早期診斷及預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及處理 自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal. gdc. cancer. gov/）下載 375 例份 HCC 組織樣本和50例份癌旁組織樣本的miRNAseq 數(shù)據(jù)和患者臨床資料、隨訪數(shù)據(jù)。匯總375例HCC患者的臨床資料，其中男256例、女119例，年齡≤60歲178例、＞60歲196例；T分期：T1～T2期279例，T3～T4期93例；N分期：N0期256例，N1期4例；M分期：M0期271例，M1期4例；病理分期：Ⅰ～Ⅱ期261 例，Ⅲ～Ⅳ期90 例；腫瘤狀態(tài)：荷瘤154 例，無瘤202 例；血清甲胎蛋白（AFP）水平：≤400 ng/mL 218例，＞400 ng/mL 65例；Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)222例，B～C級(jí)22例；血管浸潤(rùn)：無208例，有112例；肝纖維化Ishak評(píng)分：0～2分106例，3～6分112例。miRNAseq數(shù)據(jù)通過edge R軟件包進(jìn)行過濾和標(biāo)準(zhǔn)化處理獲得RPM（Reads per Million mapped reads）數(shù)據(jù)，經(jīng)log2轉(zhuǎn)換后用于后續(xù)分析。

1.2 HCC 組織中miR-5003-3p 表達(dá)分析 采用EdgeR軟件包分別分析375例份HCC組織和50例份癌旁組織，以及49例HCC患者配對(duì)癌組織和癌旁組織中的miR-5003-3p表達(dá)情況。

1.3 miR-5003-3p 表達(dá)與HCC 患者臨床參數(shù)的關(guān)系分析 375 例 HCC 患者按miR-5003-3p 表達(dá)中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，采用二分類單因素Logistics 回歸模型分析 miR-5003-3p 表達(dá)與 HCC 患者臨床參數(shù)（性別、年齡、T/N/M 分期、病理分期、腫瘤狀態(tài)、血清AFP 水平、Child-Pugh 分級(jí)、血管浸潤(rùn)、肝纖維化Ishak評(píng)分）的相關(guān)性。

1.4 miR-5003-3p 對(duì)HCC 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值分析 采用Kaplan-Meier 法比較高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的10 年總生存期（OS）、疾病相關(guān)生存期（DSS）和無進(jìn)展間隔期（PFI）。利用R 語(yǔ)言pROC 程序包繪制miR-5003-3p預(yù)測(cè)患者1、3、5年OS、DSS、PFI的受試者工作特征（ROC）曲線，通過曲線下面積（AUC）評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)效能。

1.5 HCC 患者預(yù)后危險(xiǎn)因素分析 運(yùn)用COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響HCC 患者OS 的危險(xiǎn)因素，其中單因素COX 回歸分析結(jié)果P＜0.1 的臨床指標(biāo)進(jìn)一步納入多因素COX回歸分析，總結(jié)影響HCC患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，非配對(duì)組織表達(dá)差異分析采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，配對(duì)組織表達(dá)差異分析采用t檢驗(yàn)；生存分析采用Log-Rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 組織和癌旁組織中miR-5003-3p 表達(dá)比較 HCC 組織（375 例份）和癌旁組織（50 例份）中miR-5003-3p 相 對(duì) 表 達(dá) 量 分 別 為 0.432 ± 0.429、0.160±0.233，二者比較P＜0.01。配對(duì)的HCC組織和癌旁組織（各49例份）中miR-5003-3p相對(duì)表達(dá)量分別為0.547±0.491、0.163±0.233，二者比較P＜0.01。

2.2 miR-5003-3p 表達(dá)與HCC 患者臨床參數(shù)的關(guān)系 根據(jù)miR-5003-3p 表達(dá)中位數(shù)將HCC 患者分為高表達(dá)組187例和低表達(dá)組187例。miR-5003-3p表達(dá)與T 分期（OR=1.955，P=0.006）、病理分期（OR=1.763，P=0.023）和腫瘤狀態(tài)（OR=1.659，P=0.019）有顯著相關(guān)性，而與年齡、性別、N 分期、M 分期、血清AFP、Child-Pugh 分級(jí)、血管浸潤(rùn)和肝纖維化Ishak 評(píng)分無顯著相關(guān)性（P均＞0.05）。見表1。

表1 miR-5003-3p表達(dá)與HCC患者臨床參數(shù)的關(guān)系

2.3 miR-5003-3p 表達(dá)對(duì)HCC 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 高表達(dá)組10 年OS、DSS、PFI均顯著低于低表達(dá)組（P均＜0.01），見 OSID 碼圖 1。ROC 曲線結(jié)果顯示，miR-5003-3p 預(yù)測(cè) HCC 患者 1、3、5 年 OS 的 AUC分別為 0.655、0.627、0.586，預(yù)測(cè) HCC 患者 1、3、5年 DSS 的 AUC 分別為 0.720、0.640、0.582，預(yù)測(cè)HCC 患者1、3、5 年P(guān)FI的AUC 分別為0.581、0.614、0.644，見OSID碼圖2。

2.4 影響HCC 患者OS 的危險(xiǎn)因素分析結(jié)果 見表2、3。

表2 影響HCC患者OS的單因素COX回歸分析結(jié)果

表3 影響HCC患者OS的多因素COX回歸分析結(jié)果

3 討論

越來越多的研究表明，miRNAs 在腫瘤組織中的表達(dá)失調(diào)參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥，已成為腫瘤生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)研發(fā)的重要分子類型［9-10］。由于miRNAs 屬于小分子核酸，可在各類體液中穩(wěn)定存在，展現(xiàn)出了成為包括癌癥在內(nèi)的各類疾病非侵入性診斷生物標(biāo)志物的巨大潛力，使得鑒定和開發(fā)可用于腫瘤診斷早期診斷、預(yù)后判斷和療效評(píng)估的新型miRNAs 分子標(biāo)志物逐漸成為癌癥研究領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)［11-12］。最近研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-193a-5p 可有效評(píng)估早期HCC 接受肝移植或腫瘤切除術(shù)患者的預(yù)后［13］；此外，血清miR-122對(duì)區(qū)分HCC患者與健康對(duì)照患者具有良好效果［14］。值得注意的是，近年來外泌體miRNAs作為生物標(biāo)志物受到很大關(guān)注，由于被CCC膜結(jié)構(gòu)包裹，miRNAs穩(wěn)定性強(qiáng)，可顯著提高檢測(cè)靈敏度，非常適合用于腫瘤無創(chuàng)診斷。血漿外泌體miR-1307-5p 最近被證實(shí)在HCC 轉(zhuǎn)移患者中高表達(dá)，且與腫瘤進(jìn)展分期顯著相關(guān)［15］。NAKANO 等［16］發(fā)現(xiàn)，血清外泌體 miR-92b 可作為潛在生物標(biāo)志物用于肝移植后HCC復(fù)發(fā)的早期預(yù)測(cè)。

最近研究發(fā)現(xiàn)，位于人類5 號(hào)染色體的miR-5003-3p在多種腫瘤組織中異常高表達(dá)，且在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用。在乳腺癌中，miR-5003-3p 高表達(dá)可分別上調(diào)EMT 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail和下調(diào)黏附分子E-cadhein，通過推進(jìn)EMT 進(jìn)程而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［7］。在胃癌中，miR-5003 高表達(dá)則可分別直接靶向抑制lncRNA RP11-789C1.1 和E-cadherin 表達(dá)，同樣可通過影響EMT 進(jìn)程而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［8］。目前對(duì)于miR-5003-3p 在HCC中的表達(dá)及其生物學(xué)作用則仍未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的HCC 樣本miRNAs測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床信息數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-5003-3p 在配對(duì)和非配對(duì)HCC 組織中的表達(dá)水平均較正常組織顯著上調(diào)，提示miR-5003-3p 具有作為HCC 診斷分子標(biāo)志物的潛力。本研究結(jié)合TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)HCC 患者的臨床信息數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探討了miR-5003-3p 表達(dá)水平與患者臨床參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-5003-3p 表達(dá)與患者T 分期、病理分期和腫瘤狀態(tài)相關(guān)，高表達(dá)組10 年OS、DSS、PFI 均顯著低于低表達(dá)組，且 miR-5003-3p 是影響HCC 患者OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miR-5003-3p有望成為HCC預(yù)后判斷的新型分子標(biāo)志物。本研究ROC曲線結(jié)果顯示，miR-5003-3p表達(dá)對(duì)于HCC患者的1、3、5年OS、DSS、PFI均具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，HCC 組織中miR-5003-3p 表達(dá)升高，miR-5003-3p 異常高表達(dá)不僅與患者的T 分期、病理分期、腫瘤狀態(tài)相關(guān)，還是影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同時(shí)對(duì)患者預(yù)后具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值，有望成為HCC 診斷和預(yù)后判斷的潛在生物標(biāo)志物，為后續(xù)圍繞miR-5003-3p 開展HCC 生物標(biāo)志物的相關(guān)研究提供了依據(jù)。但本研究的miR-5003-3p 表達(dá)數(shù)據(jù)僅局限于HCC組織，后續(xù)可進(jìn)一步對(duì)HCC患者血清/血漿游離或外泌體來源miR-5003-3p的表達(dá)及其臨床相關(guān)性進(jìn)行深入研究。