急性進展性缺血性腦卒中與急性非進展性缺血性腦卒中的代謝特征差異

賴敏超，朱夢婷，周丹雅，張曉娟，張 也，劉清嫻，王 典

(1．汕頭大學醫學院第一附屬醫院神經內科，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學醫學院法醫學教研室，廣東 汕頭 515041；3．汕頭大學醫學院護理系，廣東 汕頭 515041)

腦血管疾病占我國居民死因的第3位，其中缺血性腦卒中病例占全部腦血管疾病的80%以上[1]。急性進展性缺血性腦卒中(acute progressive ischemic stroke，APIS)是缺血性腦卒中的重要類型，該病征的癥狀進展快，治療效果差[2]。目前，導致APIS的病理生理機制仍未完全清楚，需從不同層面探尋相關病理生理特征[3]。血清代謝組學可反映患者整體代謝與機能狀態，有望為了解進展性腦卒中的病理生理過程和精準治療提供參考。本研究探討APIS與急性非進展性缺血性腦卒中(acute non-progressive ischemic stroke，ANPIS)患者血清代謝組的差異。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取15例APIS患者和25例ANPIS患者為研究對象。急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)的診斷標準參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[4]：(1)急性起病；(2)局灶神經功能缺損(一側面部或肢體無力或麻木，語言障礙等)，少數為全面神經功能缺損；(3)影像學出現責任病灶或癥狀/體征持續24 h以上；(4)排除非血管性病因；(5)腦CT/MRI排除腦出血。APIS的診斷參考文獻[3]：入院后至第5天期間，美國國立衛生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS)評分增加2分或以上(或出現卒中相關死亡)。其他急性缺血性腦卒中病例歸為ANPIS。排除標準為有以下情況之一：嚴重的肝腎功能不全、嚴重感染、惡性腫瘤以及無法進行頭部影像學檢查(CT/MRI檢查)。本研究經汕頭大學醫學院倫理委員會批準，入選患者均簽署知情同意書。

收集研究對象的性別、年齡、高血壓及糖尿病病史、NIHSS評分、改良Rankin量表(modified Rankin scale，mRS)評分、生化指標等臨床資料。采集研究對象空腹外周血3 mL，4℃、3 000 r/min離心5 min，分離血清，將血清凍存于-80℃待測。

1.2 代謝組分析

1.2.1 血清標本預處理 血清解凍、振蕩后，取50 μL 于 EP 管中，加 800 μL 甲醇和 50 μL 超純水，旋渦振蕩1 min；4℃，10 000 r/min離心10 min；取200 μL上清至GC管，并加入 20 μL 0.5 mmol/L正亮氨酸內標；70℃，用氮吹儀吹干約15 min；加入20 μL二氯甲烷，繼續吹干約3 min；往GC管加入30 μL甲氧胺吡啶溶液(15 mg/mL)，室溫放置16 h，加入30 μL N-甲基三甲硅基三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷作為催化劑)，室溫放置1 h后上機檢測。

1.2.2 GC-MS檢測條件 使用美國Agilent 7890/5975氣相色譜質譜聯用儀和Agilent DB-5MS色譜柱(30 m×250 μm ×0.25 μm)。色譜條件：不分流進樣，柱溫采用程序升溫，溶劑延時10 min，初始溫度60℃，保持2 min，以5℃/min升至285℃，保持10 min，載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；進樣量1 μL，進樣口溫度 230℃，接口溫度290℃。質譜條件：采用EI源，電子轟擊電壓70 eV；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；掃描方式為全掃描，掃描范圍為35～800 u。

1.2.3 代謝輪廓分析 將所檢測到的代謝指紋圖譜導入Agilent自帶的ChemStation軟件，轉換成CDF格式，運用R 2.7.2語言軟件進行質譜數據提取，生成數據矩陣，導入SIMCA 13.0.3進行偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)建模，分析患者血清的代謝輪廓。根據荷載圖分布情況以及R2Y與Q2判斷組間總體代謝輪廓的差異(R2Y反映模型的穩定性，Q2反映模型的預測性，兩者越接近1，說明模型的穩定性和預測性越好)。

1.2.4 代謝物的定性及差異分析 GC-MS代謝譜導入Chem Station軟件，參考美國國家標準與技術研究院譜庫來定性代謝物。主要參考匹配度(Match)、可能性(Probability)及保留指數(Retention index)等指標來鑒定各種代謝物。應用Chem Station軟件生成色譜圖的離子峰的峰面積，進行相對定量。差異代謝物采用人類代謝組學數據庫(HMDB，http://www.hmdb.ca/)、京都基因與基因組百科全書(KEGG，http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)篩選相關的代謝通路。

1.3 統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗；非正態分布的計量資料以中位數和四分位數間距[M(Q1,Q3)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以例數和構成比表示，組間比較用χ2檢驗；計量資料之間相關性采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

APIS組患者的出院NIHSS評分、mRS評分明顯高于ANPIS組(均P＜0.05)，提示前者預后更差，與該類患者的臨床特征相符。此外，APIS患者中，谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、肌酐等反映肝腎功能的指標高于ANPIS組(均P＜0.05)。兩組患者在性別、年齡以及高血壓、糖尿病、房顫患病率、血脂、血糖值、凝血相關指標等方面的差異無統計學意義(均P＞0.05)。見表1。

表1 患者的基本臨床信息及生化指標

2.2 代謝輪廓的差異

基于GC-MS數據的PLS-DA的荷載圖顯示兩組明顯分開，其PLS-DA荷載圖區分良好，R2Y=0.568，Q2=0.534，提示APIS患者與ANPIS患者的血清代謝組差異顯著，見圖1。

圖1 PLS-DA荷載圖

2.3 差異代謝物及相關代謝通路

患者血清中鑒定出31種代謝物，其中兩組差異有統計學意義(P＜0.05)的8種(表2)，包括在APIS患者中上調的蘇氨酸、順式棕櫚酸、棕櫚酸、反油酸、絲氨酸，以及下調的脯氨酸、次黃嘌呤、谷氨酰胺。這些代謝物所反映的代謝通路主要包括精氨酸與脯氨酸代謝、磷脂酰乙醇胺合成代謝、甘氨酸與絲氨酸代謝、嘌呤代謝、甘油酯代謝與脂肪酸代謝以及嘌呤代謝與鳥氨酸循環等(表2)。其中的6種差異代謝物與腦卒中的風險因子存在一定的相關性，特別是脂肪酸(順式棕櫚酸、棕櫚酸)與NIHSS評分存在正相關(表3)，提示其很可能參與APIS癥狀的惡化過程。

表2 APIS患者與ANPIS患者血清差異代謝物

表3 差異代謝物與腦卒中的危險因子及血生化指標的相關性

3 討論

APIS因病情進展快，預后差，是神經內科中面臨的重難點問題[2-3]。因此，進一步了解APIS的病理生理過程具有重要意義。血清代表個體的整體代謝水平，能更直接地反映患者的整體機能狀態。血清代謝組學已被用于探討腦卒中發生的病理生理機制，并篩選相關的診斷與鑒別診斷標記物[5-6]。目前應用代謝組學方法發現缺血性腦卒中的代謝障礙主要涉及氨基酸代謝、能量代謝、葉酸循環代謝和脂類代謝等。目前未見APIS代謝組學研究的報道。本研究通過比較APIS與ANPIS患者之間血清代謝組的差異，有望找到APIS相關的代謝特征，為診治提供新的線索。

本研究發現，APIS患者與ANPIS患者血清代謝輪廓差異顯著，提示代謝很可能是參與APIS病情進展與惡化的關鍵因素。本研究在血清中共篩選到了8種差異代謝物，其中上調的5種，包括2種氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸)與3種脂肪酸(順式棕櫚酸、棕櫚酸、反油酸)，提示了其相關的甘氨酸與絲氨酸代謝、甘油酯代謝、脂肪酸代謝、磷脂酰乙醇胺合成代謝等通路參與APIS。絲氨酸與脂肪酸的升高，反映了細胞膜磷脂分解的增強，提示在APIS的狀態下，細胞與細胞膜系統的破壞更明顯，梗死細胞的壞死更嚴重[7]。下調的代謝物有3種，包括2種氨基酸(脯氨酸、谷氨酰胺)與1種核苷酸前體(次黃嘌呤)；反映了在APIS狀態下脯氨酸代謝、嘌呤代謝與鳥氨酸循環、精氨酸與脯氨酸代謝可能被明顯抑制。谷氨酰胺在腦中固定轉運氨中發揮重要作用，其含量下降，提示APIS狀態下，更多的谷氨酰胺被用于氨的轉運，也提示APIS具有更顯著的神經毒性癥狀。次黃嘌呤在代謝過程可產生氧化應激，其含量的下降表明更多的次黃嘌呤代謝導致活性氧的增加[8]。該結果提示APIS狀態下具有更高的氧化應激水平，這與已報道的APIS發生機制相符[2-3]。

綜上所述，APIS患者與ANPIS患者的血清代謝組存在差異，提示APIS與嚴重的膜磷脂的破壞、神經細胞壞死、神經毒性、氧化應激有關。