一種脊髓型頸椎病慢性壓迫性動物模型的建立及評價(jià)

李成立，曲軍杰，陳松，張為*

(1.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院骨科，山東 煙臺 264100；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院脊柱外科，河北 石家莊 050000)

脊髓型頸椎病(cervical spondylotic myelopathy，CSM)是一種以運(yùn)動感覺障礙為主的常見頸椎病，病變機(jī)理為頸椎退變、韌帶異常增生鈣化等，導(dǎo)致椎管容積減少，從而繼發(fā)脊髓的慢性壓迫[1]。脊髓受到慢性機(jī)械壓迫后可繼發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞損傷、局部微循環(huán)障礙、炎癥反應(yīng)，從而造成脊髓的損傷性病變，出現(xiàn)功能障礙[2]。本研究從構(gòu)建SD大鼠脊髓型頸椎病模型基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)出發(fā)，采用聚乙烯醇-聚丙烯酰胺互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠植入大鼠C5～7椎板下，建立脊髓型頸椎病慢性壓迫性大鼠模型，研究脊髓不同壓迫程度、不同時(shí)間點(diǎn)的病理學(xué)形態(tài)變化及相應(yīng)節(jié)段椎間盤中相關(guān)炎癥因子的表達(dá)情況，并研究炎癥因子表達(dá)程度與頸椎退行性病變程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 HE 染色試劑盒(北京索來寶科技)；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal dexynucleotidyl transferase dutp nick end labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國，Promega Corporation)；Western blot抗體(上海恒斐生物科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物與模型建立

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 購入70只3個(gè)月齡健康雄性SD大鼠，從1～70編號，隨機(jī)分為三組，對照組(n=10)、輕度壓迫模型組(n=30)、重度壓迫模型組(n=30)。SD大鼠來自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2.1.2 水凝膠材料的制作 配制10%聚乙烯醇水溶液，然后用液氮進(jìn)行3次冷凍-解凍，使之成凝膠態(tài)。將上述制得凝膠置于3.0 mol/L丙烯酰胺溶液中，溶脹充分后置于60Coγ射線下進(jìn)行處理形成聚乙烯醇-聚丙烯酰胺互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠，再將其放入10%戊二醛水溶液中浸泡30 s，重復(fù)10次浸泡烘干操作，最后將制得的水凝膠用環(huán)氧乙烷消毒后備用。

1.2.1.3 建立模型 輕度壓迫模型組：通過腹腔對大鼠注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉(3 mL/kg)，然后俯臥，并固定于手術(shù)臺上。術(shù)區(qū)備皮后，碘伏反復(fù)消毒3遍后切開大鼠頸部使其C5～7椎板暴露，將椎板間韌帶部分切掉，小心將1.6 mm×0.8 mm×0.4 mm尺寸水凝膠復(fù)合物放在C5～7節(jié)段的椎板下方。重度壓迫模型組：重復(fù)上述操作，互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠尺寸為5.5 mm×1.6 mm×0.8 mm。對照組：重復(fù)上述操作但不在椎板下植入壓迫物。造模后4周、8周和12周，使用過量麻醉劑注射進(jìn)入SD大鼠腹腔處死大鼠，留取C5～7整段脊髓和椎間盤進(jìn)行后續(xù)研究。手術(shù)造模過程見圖1。

a 暴露頸椎椎板 b 剝離椎板間黃韌帶 c 植入壓迫材料 d 縫合后頸椎壓迫情況

1.2.2 主要觀察指標(biāo) 行為學(xué)評價(jià)采用改良的Rivlin斜板測試方法(見圖2)。手術(shù)前和術(shù)后的第4、8和12周，對三組大鼠的運(yùn)動行為能力觀察。每組隨機(jī)選取6只大鼠，依次放入斜板上，每只大鼠在斜板上留置10s，每只進(jìn)行3次，每次記錄最大傾斜角，取3次平均值，術(shù)后后4周、8周和12周對上述6只大鼠進(jìn)行處死，然后取C5～7節(jié)段椎間盤和脊髓部分。脊髓HE染色、凋亡細(xì)胞檢測(400倍鏡下隨機(jī)選擇8個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和Western blot對C5～7椎間盤組織內(nèi)腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)-a、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-33和IL-6 mRNA水平的變化進(jìn)行測定。余下大鼠作為備用，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后一同處死取材。

a 對照組 b 輕度壓迫模型組 c 重度壓迫模型組

2 結(jié) 果

2.1 運(yùn)動功能評價(jià)結(jié)果 對照組術(shù)后各時(shí)間運(yùn)動功能與術(shù)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而輕度壓迫模型組和重度壓迫模型組大鼠術(shù)后8周和12周所能承受的斜板角度均顯著下降，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 三組大鼠斜板爬坡試驗(yàn)結(jié)果

2.2 脊髓HE染色結(jié)果 術(shù)前大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常規(guī)則，髓鞘緊密排列，對應(yīng)的軸突和白質(zhì)均正常(見圖3a～b)。術(shù)后第4周輕度、重度壓迫模型組與對照組之間病理HE染色結(jié)果基本相同，細(xì)胞之間未見明顯改變(見圖3c～d)。術(shù)后第8周顯微鏡下觀察輕度壓迫模型組較對照組神經(jīng)元細(xì)胞變性、皺縮，有輕度脫髓鞘；重度壓迫模型組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目顯著減少，可觀察到顯著的皺縮、脫髓鞘以及空泡發(fā)生變性(見圖3e～f)。術(shù)后第12周輕度壓迫模型組較對照組神經(jīng)元細(xì)胞的變性程度增大，脫髓鞘加重，軸突空泡變性程度增大；重度壓迫模型組神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)壞死情況，脫髓鞘和軸突空泡變性程度加重(見圖3g～h)。因此，選取對照組、術(shù)后第8周組和12周組進(jìn)行后續(xù)研究。

a 輕度壓迫模型組術(shù)前 b 重度壓迫模型組術(shù)前

2.3 凋亡細(xì)胞檢測結(jié)果 脊髓壓迫組中神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡隨壓迫輕重和時(shí)間延長而逐漸增多，對照組中大鼠的脊髓中未觀察到上述損傷改變，而且神經(jīng)元細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且不同大鼠模型組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖4，表2)。

a 對照組術(shù)后8周 b 輕度壓迫模型組術(shù)后8周 c 重度壓迫模型組術(shù)后8周

表2 TUNEL陽性細(xì)胞率的比較

2.4 大鼠椎間盤中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6 mRNA的變化 輕度壓迫模型組和重度壓迫模型組大鼠椎間盤組織中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6 mRNA表達(dá)平均高于對照組(P<0.05)，且重度壓迫模型組較輕度壓迫模型組表達(dá)量高(P<0.05)。此外，隨著壓迫時(shí)間延長，輕度、重度壓迫模型組中各因子表達(dá)水平術(shù)后12周比8周明顯增高，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

圖5 術(shù)后8周和12周椎間盤中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6 mRNA表達(dá)水平

2.5 大鼠椎間盤中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6蛋白的變化 大鼠椎間盤中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6蛋白結(jié)果顯示，輕度壓迫模型組和重度壓迫模型組中壓迫越重及壓迫時(shí)間越長，各細(xì)胞因子蛋白表達(dá)越高，椎間盤相對應(yīng)的退變越嚴(yán)重，炎性蛋白表達(dá)越高。而且相關(guān)炎性因子的表達(dá)與壓迫時(shí)間也存在正相關(guān)的關(guān)系，時(shí)間越長，相關(guān)炎性蛋白因子表達(dá)越高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義(P<0.05)。此外，術(shù)后8周的TNF-α蛋白相對表達(dá)量略高于12組，這可能與大鼠個(gè)體差異有關(guān)(見圖6)。

圖6 術(shù)后8周和12周時(shí)椎間盤中IL-1β、TNF-α、IL-33和IL-6蛋白表達(dá)水平

3 討 論

CSM是頸椎病中常見的一種類型[3]，建立合適的動物模型模擬人的脊髓慢性壓迫的病變過程，對治療脊髓型頸椎病尤其重要。目前，學(xué)者們選取大鼠、兔子和狗等動物進(jìn)行CSM慢性壓迫性模型的建立[4-5]。根據(jù)學(xué)者們的不斷證實(shí)，SD大鼠頸椎構(gòu)造與人的頸椎具有高度相似性，而且成本相對低，比小鼠更容易操作，因此，采用SD大鼠構(gòu)建CSM慢性壓迫性動物模型進(jìn)行后續(xù)研究是十分理想的選擇。

關(guān)于CSM慢性壓迫動物模型的建立方法，學(xué)者們也進(jìn)行了大量的嘗試。鋼釘法[6]、球囊法[4]等常被用于CSM慢性壓迫性模型的建立，但這些壓迫方法都存在一定缺陷。如鋼釘法的鋼釘進(jìn)入深度不可控，球囊法壓迫面積不可控，造模需要動物體積較大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成本較高，難以獲得較大的標(biāo)本量等缺點(diǎn)阻礙了在科研中的應(yīng)用。隨著學(xué)者們不斷探索，膨脹壓迫材料具有壓迫方向、程度易于控制、可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，逐漸應(yīng)用到慢性脊髓壓迫頸椎病模型的建立中。其中，研究比較成熟的膨脹壓迫材料多為水凝膠，且以聚乙烯醇-聚丙烯酰胺互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠應(yīng)用最為廣泛[7-8]。因此，本研究采用該壓迫材料建立慢性脊髓壓迫頸椎病大鼠模型，并用于后續(xù)研究。

膨脹壓迫材料因其良好的生物組織相容性，吸收椎管中組織間液的水分后體積呈線性膨脹增大，使椎管容積減少，致使脊髓受壓，從而建立CSM的動物模型。先前國外有研究把一種親水性膨脹材料植入SD大鼠頸部C5～6節(jié)段椎管后方，隨著膨脹材料吸水膨脹后，位于大鼠頸部椎管內(nèi)脊髓受到的壓迫程度也逐漸增加，成功模擬出了脊髓頸椎病受壓的模型[9-10]。國內(nèi)王軍[11]通過改變吸水膨脹材料的體積大小，將不同體積的壓迫材料植入大鼠頸部C5～7椎板和硬脊膜間，形成了輕型脊髓頸椎病、重型脊髓頸椎病的動物模型。本實(shí)驗(yàn)也同樣受到了上述實(shí)驗(yàn)的啟發(fā)，通過植入兩種大小不同體積水凝膠材料，短期內(nèi)制造出輕度、重度兩種脊髓型頸椎病慢性壓迫性模型，加入對大鼠的運(yùn)動功能評價(jià)，并更深一步研究受壓節(jié)段椎間盤中炎性因子的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，探索脊髓型頸椎病慢性壓迫的發(fā)病機(jī)理。術(shù)中通過直接的觀察，發(fā)現(xiàn)脊髓后方脊膜上有毛細(xì)血管充血受壓改變，脊髓壓迫導(dǎo)致了脊髓缺血和靜脈的阻塞[12]，引發(fā)了脊髓神經(jīng)元細(xì)胞損傷，出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀。當(dāng)然本方法也有自身的缺點(diǎn)和不足，由于膨脹速度只能依靠材料本身特性，實(shí)驗(yàn)者難以人為控制其對頸髓的壓迫速度和程度。因此，吸水性膨脹材料法制造脊髓型頸椎病的慢性壓迫性動物模型，需要相關(guān)技術(shù)和材料的進(jìn)步來對其進(jìn)一步的完善和提高。

慢性脊髓損傷中神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和脫髓鞘改變在脊髓功能下降過程中起到了非常重要的作用。戎利民等[13]通過對CSM患者的尸體解剖，發(fā)現(xiàn)在椎管狹窄脊髓受壓節(jié)段有凋亡細(xì)胞的存在，并在頸椎管狹窄的小鼠模型病變節(jié)段脊髓中發(fā)現(xiàn)多種凋亡蛋白的高表達(dá)，參與并調(diào)節(jié)了脊髓受壓部位的神經(jīng)元細(xì)胞的損傷過程，說明了神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡機(jī)制在脊髓型頸椎病神經(jīng)損傷的過程中起到了非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過對脊髓病理HE染色及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對照組脊髓灰白質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，無損傷改變，術(shù)后隨著壓迫時(shí)間延長和壓迫程度增加，神經(jīng)元細(xì)胞和軸突空泡的變性，脫髓鞘逐漸加重，甚至出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞壞死，凋亡細(xì)胞陽性數(shù)也在逐漸增加，與手術(shù)建模的時(shí)間成正相關(guān)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有明顯差異。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們的CSM慢性壓迫性模型與預(yù)想結(jié)果相符合。

大量的研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤中炎性因子在椎間盤退變中起到了非常重要的作用[14-15]。我們通過PCR對椎管內(nèi)受壓節(jié)段椎間盤中的炎性因子進(jìn)行測量，各組中隨著壓迫時(shí)間延長mRNA含量逐漸增加，而且植入水凝膠尺寸越大對脊髓壓迫越重，mRNA含量越高，且兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot方法輕度、重度壓迫模型組中隨著壓迫增加，壓迫時(shí)間延長，各細(xì)胞炎性因子蛋白表達(dá)越高，說明脊髓受壓越重，受壓脊髓周圍組織中炎性蛋白表達(dá)越高。而且相關(guān)炎性因子的表達(dá)與壓迫時(shí)間之間也存在正相關(guān)，時(shí)間越長相關(guān)炎性因子表達(dá)越高。說明炎癥因子表達(dá)與壓迫程度關(guān)系密切，在脊髓型頸椎病發(fā)展過程中起到了非常重要的作用，也對我們的治療有一定啟示作用。