過敏性哮喘發病機制的生物信息學分析

楊燕霞，王 欣，魏素珍，馬 斌，柳小平

(西北民族大學 甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 730030)

0 引言

過敏性哮喘是一種呼吸道變態反應性疾病，主要表現為咳嗽、喘息和可逆性氣道阻塞[1].過敏性哮喘發病率高且治療困難，給病人造成較重的經濟負擔.傳統認為，氣道高反應性(AHR)、肺部炎癥、嗜酸性粒細胞增多和黏液增生是過敏性哮喘的標志[2].在過敏性哮喘發病過程中，嗜酸性粒細胞、T細胞、肥大細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞等免疫細胞均參與了氣道免疫炎性反應，并與患者的癥狀密切相關[3].然而關于這些免疫細胞參與過敏性哮喘發病過程的分子機制目前尚不清楚.隨著基因組在醫學基礎研究中的應用，生物信息學已經成為揭示疾病分子機制的一種重要工具.郭黎彥等[4]應用加權共表達網絡探究了支氣管哮喘中的關鍵基因和信號通路.Shan等[5]應用生物信息學鑒定了維生素D受體在支氣管哮喘中的作用.目前還沒有系統評價免疫細胞浸潤情況的研究.CIBERSORT[6]是一種基于基因表達譜數據分析免疫細胞浸潤情況的新方法.R語言即可以進行大數據分析，又可以進行數據可視化，已經成為生物信息學必不可少的分析工具.在該研究中，我們既分析了過敏性哮喘發病過程中關鍵的基因和信號通路，又應用CIBERSORT對支氣管哮喘患者免疫細胞浸潤情況進行分析，以便從免疫細胞浸潤方面闡述支氣管哮喘的發病機制.研究結果既為過敏性哮喘發病機制研究提供參考，又有助于開發過敏性哮喘新的治療方法.

1 材料和方法

1.1 數據來源

GEO(Gene Expression Omnibus,GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[7]是一個公共的基因組學數據庫，收集了大量疾病的功能基因組數據集.我們使用R語言GEOquery包[8]從GEO數據庫下載了支氣管哮喘基因數據集GSE63142中的表達譜數據.數據集GSE63142中的樣本均來源于人.此平臺基于GPL6480 Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F(Probe Name version).數據集GSE63142中共有155例支氣管上皮的樣本，其中包括哮喘病人樣本128例和正常人樣本27例.

1.2 原始表達譜數據預處理

我們使用R語言中affy包對GSE63142中的原始基因表達譜數據進行背景校檢、歸一化處理，并使用密度圖和二維PCA聚類圖展示原始數據預處理前后的結果.使用R語言中的limma包對基因表達矩陣進行差異表達分析，從而得到差異表達基因.

1.3 免疫基因的GO分析、KEGG通路分析與GSEA分析

基因本體論(gene ontology,GO)可對基因參與的生物過程進行注釋.京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)是一個手工繪制的信號通路數據庫，可對參與疾病發病機制中重要的信號通路進行注釋.基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)是用來評估一個預先定義的基因集中的基因在與表型相關度排序的基因表中的分布趨勢，從而判斷其對疾病的作用.使用R語言clusterProfiler包進行GO分析、KEGG通路富集和GSEA分析，發現顯著性基因富集的臨界值為P<0.05.

1.4 蛋白互作網絡構建與關鍵基因的篩選

STRING數據庫(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING)(http://string-db.org;version:11.0)是用于注釋蛋白質—蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡的在線工具，分析蛋白質之間的相互作用，可以對疾病中復雜的調控機制進行注釋.Cytoscape軟件可對PPI網絡進行可視化處理，其插件cytoHubba可用于識別PPI網絡中的Hub節點.將所有的免疫基因導入STRING數據庫分析并通過Cytoscape構建PPI網絡，再通過插件cytoHubba識別Hub基因.利用GOSemSim包和clusterProfiler包計算Hub基因分子功能和細胞組分的相似性，從而分析得到Hub基因的相似程度.

1.5 免疫細胞浸潤的可視化及評價

CIBERSORT(https://cibersort.stanford.edu/)是基于線性支持向量回歸的原理對免疫細胞亞型的表達矩陣進行去卷積的一個網頁工具，可用來估計免疫細胞浸潤情況.將GSE63142中的基因表達矩陣數據上傳到CIBERSORT，過濾輸出P<0.05的樣本，得到免疫細胞的表達矩陣.為了評價免疫細胞在過敏性哮喘中的浸潤情況，我們監測了免疫細胞浸潤的差異、免疫細胞浸潤的相關性和免疫細胞相互作用的網絡.R語言ggplot2包繪制小提琴圖展示了22種免疫細胞浸潤的差異；R語言corrplot包繪制相關熱圖以展示22種免疫細胞之間的相關性；R語言igraph包繪制免疫細胞浸潤的相關網絡圖以展示22種免疫細胞浸潤的互作情況，以P<0.05、|相關系數|>0.15為互作標準.

1.6 TIMER數據庫相關分析

TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是系統分析各種疾病類型免疫滲透的數據庫，利用這個數據庫可統計6種免疫浸潤細胞(B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)與基因的相關性.使用TIMER數據庫對分析結果進行初步驗證，再用TIMER數據庫對免疫細胞與過敏性哮喘中Hub基因進行相關性分析.

2 結果

2.1 原始數據預處理

對原始基因表達譜數據進行背景校檢、歸一化處理，并利用密度圖和二維PCA聚類圖對原始數據預處理的效果進行展示.密度圖結果表明，原始數據均一化效果良好(圖1A、B)；二維PCA聚類圖表明，樣本能夠分開，來源可靠(圖1C、D)，可用于后續的分析.我們通過差異表達分析，共得到1 181個差異表達免疫基因.

A、B.原始數據背景校檢、標準化處理前后基因表達密度圖；C、D.原始數據預處理前后的PCA聚類圖.

2.2 免疫基因的GO分析、KEGG通路分析與GSEA分析結果

對1 181個差異表達進行GO分析和KEGG分析.GO分析結果表明(圖2A)：過敏性哮喘發病主要與谷胱甘肽衍生物生物合成、谷胱甘肽衍生物代謝過程、核苷酸-糖代謝過程、谷胱甘肽轉移酶活性、花生四烯酸代謝過程、蛋白質N-連接糖基化、長鏈脂肪酸代謝過程、糖基化、大分子糖基化、蛋白質糖基化和細胞修飾氨基酸代謝等生物過程相關.KEGG分析結果則表明(圖2B)：花生四烯酸代謝、炎癥介質對TRP通道的調節、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路和Fc-epsilon-RI信號通路等與過敏性哮喘的發病機制關系密切.對基因表達矩陣進行GSEA分析，結果表明：IL-17信號通路、Th1和Th2細胞分化、Th17細胞分化、腫瘤壞死因子信號通路和細胞因子—細胞因子受體相互作用等通路可能參與了過敏性哮喘的發病機制.

2.3 PPI網絡和Hub基因

利用STRING數據庫構建了PPI網絡，使用Cytoscape軟件進行可視化的結果如圖3A所示.通過cytoHubba插件共得到10個Hub基因(圖3B)：C3、CX3CL1、NMU、CXCL2、ADORA3、SUCNR1、ACKR3、CXCL3、CXCL6和OPRL1.基于MF和CC來注釋并計算Hub基因間的相似性，結果表明(圖3C)：CXCL3、CX3CL1、CXCL6和CXCL2具有結構和功能的相似性，C3、ACKR3和OPRL1具有結構和功能的相似性，ADORA3和SUCNR1具有結構和功能的相似性.

A.GO分析結果；B.KEGG分析結果；C.GSEA分析結果.

A.PPI網絡；B.Hub基因相互作用網絡；C.Hub基因結構和功能的相似性.

2.4 過敏性哮喘免疫細胞浸潤結果

22種免疫細胞浸潤的差異結果顯示(圖4A)：與非哮喘病人比較，過敏性哮喘的病人支氣管中出現明顯的單核細胞、M0巨噬細胞、樹突狀細胞和中心粒細胞浸潤.22種免疫細胞相關性熱圖(圖4B)結果則顯示：單核細胞與M0巨噬細胞、樹突狀細胞呈負相關，而單核細胞與中性粒細胞呈正相關；M0巨噬細胞與樹突狀細胞也呈負相關，而與中性粒細胞呈正相關；樹突狀細胞和中性粒細胞呈正相關.22種免疫細胞互作網絡圖(圖4C)結果則顯示，中心粒細胞與單核細胞、M0巨噬細胞和樹突狀細胞具有明顯的相關性，M0巨噬細胞和樹突狀細胞關系密切，而M0巨噬細胞與單核細胞相關性較弱.

2.5 TIMER數據庫相關分析

為了進一步探究免疫細胞浸潤與過敏性哮喘發病機制的關系，我們利用TIMER數據庫分析了免疫細胞與10個Hub基因的相關性(圖5).結果表明：樹突狀細胞與CXCL3、CXCL2突變相關，M0巨噬細胞與SUCNR1、OPRL1、ACKR3突變相關，單核細胞與OPRL1、CXCL3、CXCL2、C3等基因突變相關，而與中性粒細胞相關的突變基因只有CXCL3.

圖5 Hub基因與免疫細胞的相關性熱圖

A.過敏性哮喘中免疫細胞浸潤的豐度；B.免疫浸潤相關性熱圖；C.免疫細胞相互作用網絡.

3 討論

過敏性哮喘發病主要是由于自體免疫耐受受損.目前，研究者認為[8-11]，外界刺激導致CD4+Th2細胞分泌IL-4，IL-5，IL-9、IL-13、IL-25和IL-17等亞類細胞因子，這些細胞因子可通過刺激B細胞生長、啟動免疫球蛋白同種型轉換為IgE、肥大細胞的分化、嗜酸性粒細胞增多、細胞吞噬作用和纖維化等，從而使病人產生癥狀.除此之外，氣道中的黏膜免疫細胞，如先天淋巴樣細胞(ILC，巨噬細胞，樹突狀細胞)和適應性免疫細胞(如BandT淋巴細胞)在過敏性哮喘的發病機制中也起著重要作用[12-13].目前，雖然研究者對過敏性哮喘的發病機制進行了大量的研究，但關于過敏性哮喘的分子免疫機制仍然不清楚.因此，利用生物信息學的分析方法，可對過敏性哮喘后的關鍵免疫基因和信號通路進行篩選，又能對免疫細胞的作用模式進行分析.

為了注釋過敏性哮喘發病過程中基因的功能，我們對差異表達基因進行GO分析和KEGG分析，也對基因表達矩陣進行GSEA分析.通過KEGG分析富集到了炎癥介質對TRP通道的調節、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路和Fc-epsilon-RI等信號通路.GSEA分析主要富集到IL-17信號通路、Th1和Th2細胞分化、Th17細胞分化、腫瘤壞死因子信號途徑和細胞因子-細胞因子受體相互作用等信號通路.TRP通道是一種瞬態受體電位離子通道，抑制TRP通道可緩解支氣管哮喘患者的咳嗽癥狀，是氣道疾病癥狀緩解藥物的新興分子靶標候選物[14].Fc-epsilon-RI受體是IgE高親和力受體，過敏性哮喘發病過程中產生的嗜酸性粒細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞會表現高親和力的Fc-epsilon-RI受體.IgE與該受體結合在過敏性哮喘的免疫級聯反應中發揮著重要作用[15-16].Th1和Th2細胞分化在過敏性哮喘中的作用較為明確，常常作為過敏性哮喘的治療靶細胞[17-18].氣道中本沒有Th17細胞，但在過敏性哮喘發病過程中，Th17細胞轉移至氣道中以適應不良的免疫反應，與嚴重的氣道高反應性、黏液產生以及嗜酸性/嗜中性粒細胞混合炎癥密切相關[19-20].在我們富集分析的結果中，只有腫瘤壞死因子信號通路和IL-17信號通路在過敏性哮喘中的作用目前尚未報道.我們的研究有助于發現過敏性哮喘發病過程中新的信號通路.

通過構建PPI網絡，共篩選得到10個Hub基因:C3、CX3CL1、NMU、CXCL2、ADORA3、SUCNR1、ACKR3、CXCL3、CXCL6和OPRL1.C3是血清中含量最高的補體成分，主要由巨噬細胞分泌，在補體經典激活途徑和旁路激活途徑中均發揮重要作用.相關研究表明[21-23]，C3可通過與C3a受體結合來調節白細胞激活、平滑肌收縮和血管通透性，但是關于C3補體引起支氣管哮喘病人癥狀的原理尚不清楚，有待進一步的研究.Wallrapp等研究表明[24]，NMU主要通過激活2型先天性淋巴樣細胞(ILC2)引起過敏性哮喘中的病理性炎癥反應.趨化因子家族在過敏性哮喘發病過程中也發揮著重要的作用.Goleva等[25]通過RT-PCR實驗表明，CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8(IL-8)等在過敏性哮喘中的轉錄本水平明顯升高.在過敏性哮喘發病過程中，CXCL2和CXCL6的激活能夠吸引中性粒細胞聚集到氣道中[26]，而CX3CL1主要通過調節單核細胞遷移和巨噬細胞分化以及T細胞依賴性炎癥反應在過敏性哮喘發病過程中發揮作用[27-28].目前，關于SUCNR1、OPRL1、ACKR3和ADORA3在過敏性哮喘中的作用尚不清楚，有待進一步的生物實驗驗證.

對22種免疫細胞浸潤的豐度進行分析，結果表明：與非哮喘病人相比較，過敏性哮喘的病人支氣管中出現明顯單核細胞、M0巨噬細胞、樹突狀細胞和中心粒細胞浸潤.在過敏性哮喘中，單核細胞替代胚胎肺泡巨噬細胞而發揮作用.單核細胞的TLR信號能夠促進Th2介導的嗜酸性粒細胞增多和Th1/Th17介導的嗜中性粒細胞增多[29-30].樹突狀細胞(DC)是一種抗原呈遞細胞.樹突狀細胞可通過分泌的趨化因子和炎性因子刺激CD4+T細胞活化，并分化為Th1T細胞、Th2T細胞和Th17T細胞,參與過敏性哮喘中的炎性反應[31-33].中性粒細胞主要通過分泌IL-6、IL-8、IL-13、CM-CSF和TGF-β等炎性因子參與哮喘中的炎性反應[34].以上的研究與我們分析的結果類似，說明我們的分析結果具有一定的可靠性.而M0巨噬細胞在過敏性哮喘發病過程中的作用目前尚未報道，有待進一步的研究.

分析過敏性哮喘發病過程，在免疫浸潤的基礎上揭露了免疫浸潤的細節.單核細胞與M0巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞密切相關.M0巨噬細胞與樹突狀細胞和中性粒細胞具有一定的相關性，樹突狀細胞的浸潤和中性粒細胞的浸潤相關.Radermecker等[35]研究表明，中性粒細胞可通過釋放CXCR4增強樹突狀細胞的抗原提呈作用.Machiels等研究表明[36]，單核細胞衍生的肺泡巨噬細胞具有可抑制樹突狀細胞激活輔助Th2 T細胞的作用.本研究進一步說明，我們的分析真實可靠，但對于免疫細胞間的共同作用仍然有待進一步的研究.

Hub基因與免疫細胞相關性分析的結果表明，樹突狀細胞與CXCL3、CXCL2突變相關，M0巨噬細胞與SUCNR1、OPRL1、ACKR3突變相關，單核細胞與OPRL1、CXCL3、CXCL2、C3等基因突變相關，中性粒細胞與CXCL3的突變相關.Mizutani等研究表明[37]，IL-33與IL-17A共同通過CXCL2-CXCR2信號傳導增強過敏性哮喘發病過程中中性粒細胞浸潤.我們的分析結果詳細地描述了過敏性哮喘發病過程中關鍵基因與免疫細胞浸潤的相關性，具有一定的參考價值.

綜上所述，應用生物信息學的分析方法可得到過敏性哮喘發病過程中的關鍵基因、信號通路和免疫細胞浸潤的情況，既為過敏性哮喘分子機制的研究提供了一定的參考，也有助于開發過敏性哮喘的新的靶向藥物.