環介導等溫擴增技術在病原微生物快速檢測中的應用研究進展

劉昌亞 任曉東

（昭通衛生職業學院 云南昭通 657000）

環介導等溫擴增（LAMP）技術是2000年日本學者Notomi[1]發明的一種適用于基因診斷的等溫核酸擴增技術，其特點是針對靶基因的6個區段設計4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（60℃～65℃左右）1h內即可完成核酸擴增反應。該技術具有以下優點：

1.特異性高。環介導等溫擴增過程中有2對引物確保反應的特異性，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（60℃～65℃左右）1h左右即可完成核酸擴增反應。而傳統PCR只有一對引物，因此LAMP法擴增產物的特異性更高。

2.靈敏度高。等溫擴增反應過程中不需歷經溫度反復變化，從而擴增酶能保持更好的活性，有助于反應的發生，這些優點有利于此方法的靈敏度提高。

3.檢測時間短。整個反應時間約為1小時，比傳統PCR過程要縮短近1小時，比血培養縮短至少24小時，有利于快速為患者提供服務[2]。

4.易操作和污染風險低。只需將DNA模板加入反應體系即可檢測，加樣后反應孔封閉，檢測完成后不需要對產物進行再次分析可避免產物污染的風險。

5.成本低因為反應過程簡單，故相對于RT-PCR來說對儀器性能要求沒那么高，因此也降低了設備的費用，適合基層醫院做出病原菌的快速診斷[2-3]。

6.技術門檻相對較低。整個操作過程中只涉及核酸提取和擴增，而這兩步操作均可實現自動化操作，因此對人員的要求相對降低，也降低了此技術的門檻，有利于技術在臨床的推廣。

LAMP其工作原理包括三個步驟：1.起始反應物模板的合成，即先由外引物擴增出內引物擴增所需的模板，起始階段時間很短；2.循環擴增階段。即由內引物引導合成靶基因DNA片段。由于內引物擴增的DNA片段含有5’端DNA片段的反向互補序列，因而反向互補序列之間可通過雜交形成莖環結構，另外一條內引物與其互補鏈退火雜交后引導鏈置換合成反應，在擴增的DNA片段的另外一端產生了新的莖環結構，形成啞鈴結構，如此往復循環，最后形成菜花樣結構；擴增循環階段占全面擴增時間的95%以上。

一、LAMP技術在細菌鑒定中的應用

（一）腦脊液結核分枝桿菌

結核性腦膜炎（TBM）是中樞神經系統的致命并發癥[4]。治療TBM的主要問題在于早期診斷不及時。TBM的診斷依賴于抗酸桿菌（AFB）染色和細菌培養對腦脊液結核分枝桿菌的檢測，但腦脊液的AFB染色并不十分敏感。雖然TBM在培養時的敏感性優于AFB染色，但它需要3～5周的時間，因此無法提供適當的、及時的診斷[5]。Khushboo等人的研究中使用LAMP分析方法對27個腦脊液標本進行回顧性分析，并將結果與PCR檢測結果進行比較。LAMP分析靈敏度為10CFU/100uL，PCR的分析靈敏度為20CFU/100uL，低于LAMP的分析靈敏度。一些低濃度細菌的樣本用LAMP法檢測是陽性的，但PCR檢測是陰性的。進一步觀察，這些實際陽性但利用PCR檢測結果陰性的樣本具有較低的OD值，通過患者隨訪進一步分析這些樣本，證實它們是陽性樣本。這表明，LAMP對于檢測早期疾病的TBM病例靈敏度更高。

（二）沙門氏菌

沙門氏菌（Salmonella）是引起食源性疾病的主要病原菌，在我國食源性疾病中，沙門菌是最主要的致病因子之一。目前所使用的沙門氏菌分離培養、生化反應、血清學和PCR技術等檢測方法在操作程序、檢測時間、特異性和靈敏度方面都不理想。2019年，李陽等用LAMP對生理鹽水作倍比稀釋的沙門菌進行檢測，檢出時間為40min，最低檢測限達8.7×100cfu/mL，靈敏度比PCR高100倍；對人工污染雞蛋內容物中沙門菌的最低檢測限達9.5×100cfu/mL。本實驗的擴增現象只在沙門菌中發生，而在其他細菌中無擴增現象[6]。可見，LAMP是一種更快速、更靈敏、特異性更高的檢測技術。

二、LAMP技術在病毒鑒定中的應用

（一）人乳頭瘤病毒

高危型人乳頭瘤病毒（HPV）是子宮頸癌的病原體，通過檢測高危型HPV的DNA作為主要篩查工具。HPV基因型16和18是全世界最流行的基因型[7-8]。HPV基因型45在世界所有地區都非常流行，并經常在宮頸上皮內瘤變（CIN 2+）和侵襲性宮頸癌（ICC）中發現，其中2～8%的為子宮頸癌[7-8]。HPV基因型52和58在亞洲人群中普遍存在，尤其是在中國[9]。羅樂等人的研究中，使用HNB染色的LAMP法對檢測高危HPV基因型16、18、45、52和58型進行檢測，檢測的靈敏度分別為100、10、100、10、100個拷貝/管，LAMP法只擴增了各自類型的HPV DNA，沒有交叉反應，通過LAMP法檢測的陽性率和PCR法基本一致。基于使用HNB染色的LAMP檢測方法的簡單性和成本效益，使得它更適合在臨床環境中快速檢測，特別是在資源有限的醫院或農村診所。

（二）丙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒（HCV）是人類慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌發生的重要病因。HCV感染的實驗室診斷主要采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和PCR分別檢測抗體和HCV-RNA[10]。HCV抗體檢測是非常有效的方法，但HCV感染后，抗HCV抗體出現得較慢，所以該病毒感染早期無法用常規的免疫學方法檢測出病毒抗體。PCR法檢測不僅過程繁瑣，而且特異性低和易交叉污染。隨著LAMP技術的出現，趙娜等人利用RT-LAMP進行臨床樣本丙型肝炎病毒檢測，RT-LAMP的特異性與靈敏度分別為100%、92.31%；而以FQ-PCR為金標準的檢測方法，特異性雖為100%，但靈敏度只有69.23%[11]。RT-LAMP的假陰性率低于FQ-PCR，臨床陽性標本漏檢率低。

三、LAMP技術在真菌鑒定中的應用

（一）假絲酵母菌

假絲酵母菌是一類深部感染真菌，對人致病的有白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等，其中以白假絲酵母菌感染最為多見，可占感染的75%，白假絲酵母菌是重要的條件致病菌，占深部真菌感染的首位[12]。林江等人通過LAMP技術對實驗菌株和對照菌株的研究顯示：假絲酵母菌各菌種均能進行特異性的LAMP反應，靈敏度達102CFU/mL，為PCR的10倍；通過對52份臨床樣品分別進行培養和LAMP檢測證實，LAMP方法在陽性率、靈敏度方面明顯優于培養法[13]。

（二）新型隱球菌

新型隱球菌是一種條件致病菌，當機體免疫功能下降時可向全身播散，主要侵犯中樞神經系統，引起真菌性腦膜炎、腦炎、腦肉芽腫等，其中引起的腦膜炎在艾滋病患者中非常常見。李東冬等人選取引起腦膜炎最常見的11種病原菌，通過LAMP法進行特異性擴增，發現僅對新型隱球菌產生擴增，特異性好；且LAMP檢測新型隱球菌的靈敏度為102/mL，與熒光PCR的最低檢測線相同，敏感度高[14]。

四、LAMP技術在寄生蟲鑒定中的應用

（一）隱孢子蟲

隱孢子蟲中最為常見的是微小隱孢子蟲，引起的隱孢子蟲病是一種以腹瀉為主要臨床表現的人畜共患原蟲病。隱孢子蟲是重要的機會致病性原蟲，WHO于1986年將人隱孢子蟲病定為艾滋病懷疑指標之一。史亞東等人利用LAPM檢測微小隱孢子蟲的檢測限度是5×100個卵囊/uL，檢測靈敏度為常規PCR的10倍[15]，特異性實驗中微小隱孢子蟲出現特異梯裝條帶，賈第蟲、球蟲、類圓線蟲、腸阿米巴及雙蒸餾水無特異梯裝條帶，特異性好。

（二）弓形蟲

弓形蟲病是由剛地弓形蟲所引起的人畜共患病。它廣泛寄生在人和動物的有核細胞內。弓形蟲的檢測過去普遍采用ELISA，但該方法特異性和靈敏度低。以PCR為基礎的分子生物學檢測技術雖然快速、靈敏，但假陽性高。宇芙蓉等人利用LAMP檢測方法對臨床100例弓形蟲IgG或（和）IgM抗體陽性血液及50例陰性參考血液標本進行檢測，并和PCR檢測方法進行靈敏度和特異性比較。LAMP檢測的靈敏度為10-8，PCR檢測的靈敏度為10-6，LAMP靈敏度為PCR的100倍。在LAMP檢查中100例均檢測陽性，陽性率為100%，遠高于PCR檢測方法中74%的陽性率，且50例陰性參考血液標本陽性率為0%，具有很好的特異性[16]。

五、LAMP檢測技術發展前景展望

在2000年LAMP檢測技術發明以來，各個方面的研究報道逐年增加。LAMP是一種特異性強、靈敏度高、便捷快速的基因檢測技術，如果對其進一步進行優化、完善，該技術必將在病原微生物診斷領域發揮極其重要的作用。若研發出碟式微流控芯片，將多種細菌的引物同時設計在該芯片上，可同時對多種細菌同時進行檢測，對于臨床疾病的診斷和合理的用藥提供重要的依據。我們有理由相信，LAMP作為一種核酸擴增的快速檢測方法，在病原體基因檢測方面發揮重要作用并逐漸應用于臨床。