青蒿琥酯通過Akt/HO-1 信號通路抑制誘導H2O2 的晶狀體上皮細胞氧化應激和凋亡

覃暉，賴莉

白內障是因眼睛晶狀體混濁而引起的一種視力障礙性眼病[1]，可以通過手術方式進行人工合成的晶狀體置換，但后期會出現(xiàn)一些不良反應[2]。白內障發(fā)病機制尚不清楚，手術是目前唯一有效的治療方法，其并發(fā)癥風險與術前視力、年齡及眼部疾病等因素相關[3-4]。活性氧（reactive oxygen species，ROS），如過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）引起的氧化應激，是導致白內障發(fā)生的主要因素[5]。氧化應激是人晶狀體上皮細胞凋亡的重要調節(jié)因子，被廣泛認為是白內障發(fā)生和發(fā)展的共同分子機制[6]。因此，保護人晶狀體上皮細胞免受H2O2誘導的氧化應激和凋亡，可能是延緩白內障發(fā)展的重要治療策略。

青蒿琥酯（artesunate，Art）具有抗炎、免疫調節(jié)及抗氧化應激的作用[7]。前期有關研究[8]報道，Art 能夠抑制由于缺氧誘導的小神經膠質細胞BV-2 的激活，降低了細胞氧化應激損傷和炎癥因子的釋放。然而，目前尚不清楚Art 是否會影響H2O2誘導的HLEB3 細胞氧化應激和凋亡。人晶狀體上皮細胞暴露于H2O2會引起氧化應激損傷和凋亡，最終導致白內障的發(fā)生[9]。因此，實驗利用H2O2刺激HLEB3 細胞模擬白內障發(fā)病的特點，觀察Art 對H2O2誘導的HLEB3 細胞氧化應激和凋亡的影響，并進一步探討相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 HLEB3 細胞

人晶狀體上皮細胞系HLEB3 細胞購自武漢巴菲爾生物有限公司，采用DMEM 培養(yǎng)基（包含10%胎牛血清和1%青霉素（110 U/mL）-鏈霉素（100 μg/mL））在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。當細胞長滿瓶底的80%～90%時便可進行傳代培養(yǎng)，將對數(shù)生長期細胞接種于6 孔板，待細胞融合至50%，進行后續(xù)藥物處理。

1.2 主要試劑

鼠抗Bcl-2、鼠抗Bax、鼠抗β-actin（英國Abcam公司），兔抗Akt、兔抗p-Akt、鼠抗HO-1、羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗（美國Proteintech 公司）。膜聯(lián)蛋白V（annexin-V）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒（海南Beyotime Inst.Biotech 公司），CCK8 試劑盒（日本Dojindo 公司），青蒿琥酯（美國Sigma 公司，批號：446-36-2），Akt 抑制劑LY294002和HO-1 抑制劑ZnPP（美國Sigma 公司）。

1.3 分組

不同濃度H2O2（0、50、100、200、400 μM）處理HLEB3 細胞24h，不同濃度Art（0、10、50、100、200μM）干預細胞24 h，及二者聯(lián)合處理24 h。后續(xù)實驗將細胞分為對照組（A 組）、H2O2組（100 μM 的H2O2處理細胞24 h，B 組）、H2O2+Art 組（100 μM 的H2O2和100 μM 的Art共同處理細胞24 h，C 組）、H2O2+LY294002（LY）組（先采用15 μM 的LY 預處理細胞30 min，再加入100 μM 的H2O2處理24 h，D 組）、H2O2+ZnPP 組（先采用10 μM 的ZnPP 預處理細胞30 min，再加入100 μM 的H2O2處理24 h，E 組）、H2O2+Art+LY 組（先采用15 μM 的LY 預處理細胞30 min，再加入100 μM 的H2O2和100 μM 的Art 共同處理24 h，F(xiàn) 組）和H2O2+Art+ZnPP 組（先采用10 μM的ZnPP 預處理細胞30 min，再加入100 μM 的H2O2和100 μM 的Art 共同處理24 h，G 組）。

1.4 CCK8 實驗

HLEB3 細胞接種于96 孔板（1×104個細胞/孔）培養(yǎng)過夜，然后按照“1.3”項處理細胞。待藥物處理完成，吸干每孔中的舊培養(yǎng)液，加入10 μL 的CCK8 試劑，繼續(xù)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，在酶標儀450 nm 波長處測定細胞吸光度值，并計算細胞活力。

1.5 流式細胞分析

采用Annexin-V/PI 凋亡試劑盒測定HLEB3 細胞凋亡率。收集各組細胞，首先加入Annexin-V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）試劑在常溫下孵育10 min，離心，用PB 緩沖液清洗細胞，PBS 重懸細胞，PI 孵育15 min 后進流式細胞儀分析。

1.6 氧化應激指標測定

收集各組細胞，用PBS 緩沖液清洗細胞2 次，超氧化物歧化酶Orgotein（superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）根據其測定試劑盒的操作說明書進行，然后用酶標儀測定吸光度值。

1.7 qRT-PCR 實驗檢測HO-1 mRNA 表達

各組細胞總RNA 采用TRIzol 試劑（美國Thermo Fisher Scientific 公司）提取，并按照PrimeScript RT 試劑盒操作流程逆轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，采用SYBR RT-PCR 試劑盒（日本Takara 公司）說明書進行PCR 實驗。反應條件如下：95℃反應5 min，38 個循環(huán)95℃反應15 s，退火溫度60℃反應30 s。引物序列如下（表1）。采用2-ΔΔCq方法分析基因相對表達水平，采用β-actin 標準化，實驗重復操作3 次。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.8 Western blot實驗檢測Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt和HO-1蛋白表達

收集各組細胞，PBS 緩沖液清洗細胞2 次，每孔加入200 μL 的RIPA 裂解液，在冰上充分裂解30 min。4 ℃、12，000 g 條件下離心12 min，收集上清，并用BCA 試劑盒測定每個樣本的蛋白濃度。然后每個樣加入50 μg 蛋白進行電泳分離，恒壓70 V 電泳3 h，接著恒流275 mA 進行電轉60 min 至NC 膜。根據marker 分子量位置，將目的條帶切割下來放于相應一抗抗體溶液（稀釋比為1:1000）中4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min；將條帶放于盛二抗溶液（稀釋比為1:3000）中室溫孵育1 h；TBST 洗膜3 次，每次10 min；電化學發(fā)光（ECL）緩沖液浸泡條帶4 min，最后曝光，并用Image 軟件分析蛋白灰度值。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據分析。首先進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗。若數(shù)據符合正態(tài)分布，則采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組組間比較采用LSD-t法，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Art 對HLEB3 細胞活力影響

H2O2對細胞活力影響：5 組間細胞活力比較，差異有統(tǒng)計學意義（F活力=34.672，P=0.000）。與0 μM的H2O2組比較，50、100、200、400 μM 的H2O2組 細胞活力逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義（t50μM=23.521，t100μM=35.025,t200μM=46.957,t400μM=81.526,均P=0.000），與50 μM 的H2O2組比較，100、200、400 μM 的H2O2組細胞活力逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義（t100μM=31.503，t200μM=46.315,t400μM=66.259,均P=0.000），與100 μM的H2O2組比較，200、400 μM 的H2O2組細胞活力逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義（t200μM=16.347,t400μM=38.642，均P=0.000），與200 μM 的H2O2組比較，400 μM 的H2O2組細胞活力降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.371，P=0.018）（圖1A）。

Art 對細胞活力的影響：5 組間細胞活力比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。并且各Art 組間細胞活力比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1B）。

Art 對H2O2處理的細胞活力影響：6 組間細胞活力比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=26.794，P=0.000）。與對照組比較，100 μM 的H2O2組、H2O2+10 μM 的Art組、H2O2+50 μM 的Art 組、H2O2+100 μM 的Art 組和H2O2+200 μM 的Art 組細胞活力均降低，差異有統(tǒng)計學意義（tH2O2=34.364，t10μM=24.317，t50μM=16.684，t100μM=11.328，t200μM=8.346，均P=0.000）；與100 μM 的H2O2組比較，H2O2+10 μM 的Art 組細胞活力升高不顯著（F=1.035，P=0.659），H2O2+50 μM 的Art 組、H2O2+100 μM 的Art 組和H2O2+200 μM 的Art 組細胞活力均升高，差異有統(tǒng)計學意義（t50μM=7.359，t100μM=17.358，t200μM=29.658，均P=0.000）；與H2O2+10 μM的Art 組比較，H2O2+50μM 的Art 組（t=4.367，P=0.024）、H2O2+100 μM 的Art 組（t=11.349，P=0.000）和H2O2+200 μM 的Art 組（t=26.342，P=0.000）細胞活力均升高，差異有統(tǒng)計學意義；與H2O2+50 μM 的Art 組比較，H2O2+100 μM 的Art 組和H2O2+200 μM 的Art 組細胞活力均升高，差異有統(tǒng)計學意義（t100μM=14.066，t200μM=22.381，均P=0.000）；與H2O2+100 μM 的Art組，H2O2+200 μM 的Art 組細胞活力升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.316，P=0.000）（圖1C）。

圖1 Art 抑制H2O2 誘導的HLEB3 細胞活力降低。* 與0 μM 的H2O2 或Art 組比較，P＜0.05；# 與H2O2 組比較，P＜0.05。1A 不同濃度H2O2 誘對細胞活力的影響；1B 不同濃度Art 對細胞活力的影響；1C H2O2 誘和Art 聯(lián)合干預對細胞活力的影響

2.2 Art 對H2O2 誘導的HLEB3 細胞氧化應激反應影響

SOD 活性：3 組間SOD 活性比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝21.634，P＝0.000）。與A 組比較，B 組、C組SOD 活性均降低（tB組＝31.024，tC組＝11.347，均P＝0.000），差異與有統(tǒng)計學意義；與B 組比較，C 組SOD 活性升高，差異有統(tǒng)計學意義（t＝21.526，P＝0.000）（圖2A）。

CAT 活性：3 組間CAT 活性比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝15.607，P＝0.000）。與A 組比較，B 組、C 組CAT 活性均降低（tB組＝43.629，tC組＝9.566，均P＝0.000），差異與有統(tǒng)計學意義；與B 組比較，C 組CAT 活性升高，差異有統(tǒng)計學意義（t＝25.564，P＝0.000）（圖2B）。

GSH 活性：3 組間GSH 活性比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝38.347，P＝0.000）。與A 組比較，B 組、C 組GSH 活性均降低（tB組＝31.416，tC組＝7.364，均P＝0.000），差異與有統(tǒng)計學意義；與B 組比較，C 組GSH活性升高，差異有統(tǒng)計學意義（t＝11.503，P＝0.000）（圖2C）。

MDA 水平：3 組間MDA 水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝23.614，P＝0.000）。與A 組比較，B 組、C 組MDA 水平均升高（tB組＝26.342，tC組＝11.358，均P＝0.000），差異與有統(tǒng)計學意義；與B 組比較，C 組MDA 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（t＝6.215，P＝0.000）（圖2D）。

圖2 Art 抑制H2O2 誘導的HLEB3 細胞氧化應激反應注：* 與A 組比較，P＜0.05；# 與H2O2 組比較，P＜0.05。A 組 對照組；B 組H2O2 組；C 組H2O2+Art 組

2.3 Art 對H2O2 誘導的HLEB3 細胞凋亡比較

細胞凋亡率：3 組間細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝49.356，P＝0.000）。與A 組比較，B 組、C組的HLEB3 細胞凋亡率逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義（tB組＝53.264，tC組＝21.317，均P＝0.000），與B 組比較，C 組的HLEB3 細胞凋亡率逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義（t＝10.629，P＝0.000）（圖3）。

Bax 表達水平：3 組間Bax 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝34.751，P＝0.000）。與A 組比較，B組、C 組的HLEB3 的Bax 表達水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（tB組＝32.169，tC組＝16.952，均P＝0.000），與B 組比較，C 組的Bax 表達水平逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義（t＝14.317，P＝0.000）（圖3）。

Bcl-2 表達水平：3 組間Bcl-2 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝29.648，P＝0.000）。與A 組比較，B 組、C 組的HLEB3 的Bcl-2 表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（tB組＝49.634，tC組＝13.206，均P＝0.000），與B 組比較，C 組的Bcl-2 表達水平逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義（t＝22.528，P＝0.000）（圖3）。

圖3 Art 抑制H2O2 誘導的HLEB3 細胞凋亡

2.4 Ar 對HLEB3 細胞中Akt/HO-1 信號轉導比較

p-Akt 表達水平：3 組間p-Akt 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝46.391，P＝0.000）。與A 組比較，B組、C 組的HLEB3 的p-Akt 表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（tB組＝38.561，tC組＝13.605，均P＝0.000），與B 組比較，C 組的p-Akt 表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（t＝26.146，P＝0.000）（圖4A、4B）。

HO-1 表達水平：3 組間HO-1 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝34.268，P＝0.000）。與A 組比較，B 組、C 組的HLEB3 的HO-1 表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（tB組＝41.028，tC組＝16.957，均P＝0.000），與B 組比較，C 組的HO-1 表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（t＝26.551，P＝0.000）（圖4A、4C）。

圖4 Art 對HLEB3 細胞中Akt/HO-1 信號通路活化的影響

2.5 Akt 抑制劑LY 對HO-1 mRNA 表達水平的影響

HO-1 mRNA 水平：5 組間HO-1 mRNA 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝39.651，P＝0.000）。與A 組比較，B 組、D 組、C 組和F 組HO-1 mRNA 表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（tB組＝31.264，tD組＝59.371，tC組＝8.624，tF組＝24.309，均P＝0.000）；與B 組比較，D 組HO-1 mRNA 表達水平降低（t＝13.624，P＝0.000），C 組和F 組HO-1 mRNA 表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（tC組＝16.827，tF組＝9.915，均P＝0.000）；與D 組比較，C 組和F 組HO-1 mRNA 表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（tC組＝42.138，tF組＝25.064，均P＝0.000）；與C 組比較，F(xiàn) 組HO-1 mRNA 表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（t＝11.503，P＝0.000）（圖5）。

圖5 Akt 抑制劑LY 對HLEB3 細胞中HO-1 表達水平的影響

2.6 Art 通過Akt/HO-1 信號通路降低HLEB3 細胞氧化應激反應

SOD 活性：5 組間SOD 活性比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝34.051，P＝0.000）。與A 組比較，B 組、F 組和G 組SOD 活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（tB組＝25.304，tF組＝11.248，tG組＝9.647，均P＝0.000）；與B 組比較，C組、F 組和G 組SOD 活性升高，差異有統(tǒng)計學意義（tc組＝16.852，tF組＝7.536，tG組＝10.623，均P＝0.000）；與C組比較，F(xiàn) 組和G 組SOD 活性降低，差異有統(tǒng)計學意義（tF組＝9.634，tG組＝7.264，均P＝0.000）；與F 組比較，G 組SOD 活性升高不顯著，差異無統(tǒng)計學意義（t＝0.968，P＝0.652）（圖6A）。

MDA 水平：5 組間MDA 水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝22.319，P＝0.000）。與A 組比較，B 組、F 組和G 組MDA 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（tB組＝42.306，tF組＝32.257，PG組＝29.164，均P＝0.000）；與B 組比較，C 組、F 組和G 組MDA 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（F＝5.235，P＝0.000）；與C 組比較，F(xiàn) 組和G 組MDA 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（tF組＝21.025，tG組＝18.964，均P＝0.000）；與F 組比較，G 組MDA 水平升高不顯著，差異無統(tǒng)計學意義（t＝0.568，P＝0.854）（圖6B）。

圖6 Art 通過激活Akt/HO-1 信號通路抑制H2O2 誘導的HLEB3 細胞氧化應激反應

3 討論

白內障幾乎占全球失明病例的一半，給許多國家造成了巨大的社會和經濟負擔。目前，還沒有普遍接受的藥物能夠很好的抑制晶狀體混濁的發(fā)生，因此，有必要尋找替代藥物干預來延緩白內障的發(fā)展[10]。作為抗瘧的藥物Art，其是一種有效的抗氧化劑和自由基清除劑。例如，Art 通過激活PI3k/Akt 信號途徑對類風濕性關節(jié)炎模型大鼠軟骨細胞增殖、凋亡和自噬產生影響[11]。除此之外，Art 抑制大腸癌鼠模型中炎癥反應和氧化應激，發(fā)揮抗腫瘤的作用[12]。Art 可通過調節(jié)抗氧化酶CAT、SOD 和HO-1 表達起著保護肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的功能。另外，已有研究[13]指出，Art 可通過降低ROS 水平保護眼角膜免受氧化應激損傷。由此說明，Art 對眼部疾病具有保護作用。因此，實驗推測Art 能在H2O2刺激的晶狀體上皮細胞中起著抗氧化應激和凋亡的作用。本文提出，Art 減輕H2O2誘導的氧化應激和細胞凋亡，這與Akt/HO-1 信號通路激活相關。

目前普遍認為，氧化應激的發(fā)生是由于抗氧化防御機制與細胞內氧化作用的失衡導致[14]。眼睛晶狀體具有抗氧化防御系統(tǒng)，保護細胞免受氧化損傷，包括大量的抗氧化酶SOD 和CAT，以及非酶類抗氧化還原型谷胱甘肽GSH。H2O2是活性氧的主要成分，在晶狀體和房水中大量積累[15]。當晶狀體暴露于H2O2時，這些天然的抗氧化防御系統(tǒng)被破壞，包括白內障與晶狀體中SOD 和CAT 活性的降低及MDA含量增高[16]。越來越多的證據[17]表明，H2O2等氧化劑可以引發(fā)晶狀體上皮細胞凋亡，導致白內障的形成。因此，本研究以H2O2作為傳統(tǒng)氧化應激的誘導劑，構建HLEB3 細胞氧化應激損傷。實驗結果發(fā)現(xiàn)，H2O2呈劑量依賴性的降低HLEB3 細胞活力，提示H2O2具有細胞毒性作用。同時，H2O2處理的HLEB3細胞中SOD、CAT 和GSH 活性有明顯的降低，且MDA 含量顯著增高，表明H2O2誘導了HLEB3 細胞氧化應激損傷。此外，H2O2通過調節(jié)Bax 和Bcl-2 的表達，誘導HLEB3 細胞凋亡。但是，Art 處理可以減輕H2O2誘導的HLEB3 細胞活力下降，降低細胞氧化應激反應和凋亡，提示Art 對白內障具有保護作用。

HO-1 是一種降解血紅素的限速酶，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等多種功能[18]。以往的研究[19]報道，HO-1 通過增加抗氧化酶活性，減少ROS 的產生，從而抑制Caspase 家族依賴的細胞凋亡，來保護晶狀體上皮細胞對抗H2O2誘導的氧化應激。Akt 信號通路是一種重要的生存途徑，在抗氧化和抗凋亡中起著重要作用[20]。更重要的是，Akt 途徑參與了HO-1 介導的抗氧化反應的調節(jié)，并激活HO-1 以防止氧化應激[21]。本研究表明，H2O2刺激可以減少Akt的磷酸化，增加HLEB3 細胞中HO-1 的表達。Akt 抑制劑LY 可降低H2O2刺激的HLEB3 細胞中HO-1的表達，表明Akt 是HO-1 通路的上游信號。除此之外，Art 可增高H2O2刺激的HLEB3 細胞中p-Akt 和HO-1 表達，然而LY 和ZnPP 可部分逆轉Art 對H2O2刺激的HLEB3 細胞氧化應激損傷的保護作用。綜上所述，Art 通過激活Akt/HO-1 信號通路保護H2O2誘導的氧化應激和細胞凋亡，提示Art 對氧化應激損傷誘導白內障具有保護作用。