尖葉石竹蠟質突變體的耐鹽生理響應

王金剛，劉建華，王奧夫，龔束芳，喬 坤，周愛民

（東北農業大學園藝園林學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

鹽和干旱是植物生長發育過程中經常受到的兩種環境脅迫，它們均會引起滲透脅迫導致植物失水，從而對植物產生不同程度的危害，嚴重的滲透脅迫使細胞質中的水分進入細胞外空間引起細胞脫水[6]。表皮蠟質可以在植物表面形成一層疏水蠟被，具有維持水分平衡、防止水分流失的重要功能[1]。研究表明，除氣孔外，角質層是控制水分狀況的另外一個蒸騰屏障，是水果采收后保持水分含量的一個重要因素[7]。Parsons 等[8]分析了來自世界各地50種辣椒(Capsicum)的果實表皮組成與采后失水率的相關性，結果表明，角質層組成成分的差異導致水分流失的顯著差異，并且烷烴的含量和組成是透水性的重要決定因素。表皮蠟質在調節植物非氣孔性失水、提高植物的抗旱性方面具有重要作用[9-10]。在遭受干旱脅迫時，擬南芥(Arabidopsis thaliana)葉片蠟質含量顯著增加，葉片失水減緩，表明表皮蠟質在介導干旱脅迫中發揮作用[11]。研究表明，鹽(NaCl)脅迫處理同樣會引起擬南芥葉表皮蠟質的積累[9]。在大麥(Hordeum vulgare)中，蠟質成分作為水分損失的屏障，有助于提高鹽脅迫抗性[12]。鹽脅迫導致西蒙德木(Simmondsia chinensis)產生生理干旱，表現為水分利用效率和相對含水量的降低，而蠟質沉積增加提高了植物對鹽脅迫的耐受性[13]。這些研究說明表皮蠟質在植物應對鹽脅迫誘導的滲透脅迫中同樣發揮作用。

尖葉石竹(Dianthus spiculifolius)為石竹科石竹屬多年生草本植物，具有極強的抗寒和耐旱能力，葉片比較堅韌，耐踐踏且成坪致密，栽培養護簡單，需水量少，具有較高的觀賞和應用價值，是較理想的觀賞性草坪草材料。有研究利用甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone, EMS)對尖葉石竹種子進行了誘變處理[14]，經鑒定從誘變后代中獲得了一個尖葉石竹高表皮蠟質突變體，并表現出較強的耐旱表型[15]。基于此，本研究對尖葉石竹野生型和蠟質突變體進行耐鹽性比較，分析其表皮蠟質與耐鹽性的關系，旨在闡明表皮蠟質在植物應答鹽脅迫中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為尖葉石竹野生型和蠟質突變體，蠟質突變體的獲得和鑒定參閱文獻[14-15]，兩種材料種植于東北農業大學(中國哈爾濱，128.4° E，45° N)校園苗圃內，并于2019 年8 月通過無性扦插方式在園藝溫室內培養。

1.2 試驗設計

尖葉石竹蠟質突變體和野生型扦插幼苗生長至8～10 cm 時，選取生長健壯、長勢一致的幼苗從苗盤移出，用清水洗凈根部泥土，置于組培瓶中，用含有不同濃度NaCl 的Hoagland 營養液對幼苗進行鹽脅迫處理，NaCl 濃度梯度設置為0、50、100、150、200、250 和300 mmol·L?1，處理時間24 h。另外，用含有200 mmol·L?1NaCl 的Hoagland 營養液分別處理0、3、6、12、24 和48 h。每個處理選取蠟質突變體與野生型幼苗各3 株，處理完成后每株采集3 份中部3～6輪葉片，每份0.1 g，用去離子水沖洗干凈，吸干水分，將葉片混合均勻，用液氮冷凍后貯藏于-80 ℃超低溫冰箱中待用，對于不能冷凍測量的指標，如光合參數、葉綠素熒光參數，則在處理時間到達后及時測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 相對含水量、葉片持水力測定

測量方法參考Seo 等[9]。

1.3.2 抗氧化酶活性及滲透調節物質含量測定

丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量采用硫代巴比妥酸顯色(thiobarbituric acid, TBA)法測定[16]，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxide, POD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性和可溶性糖含量的測定分別采用SOD、POD、CAT 和植物可溶性糖含量測試試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)測定。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250 染色法進行測定[17]，游離脯氨酸含量采用茚三酮顯色法進行測定[18]。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計數資料采用率或百分比表示，兩組比較用卡方檢驗。正態分布的計量資料描述采用兩組比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料描述用中位數(M)和四分位數間距(P25-P75)表示，組間比較采用秩和檢驗。多因素分析采用Logistic回歸分析，計算其OR值，P<0.05為差異有統計學意義。

1.3.3 光合參數的測定

每個處理選取尖葉石竹蠟質突變體與野生型各3 株，每株選取相同部位、相同大小的3 個葉片，用LI-6400 便攜式光合作用測定系統(美國LI-CoR公司)，于上午10:00-12:00 測定鹽處理后的尖葉石竹蠟質突變體與野生型葉片光合參數，凈光合速率(net photosynthetic rate, Pn)、氣孔導度(stomatal conductance,Gs)、蒸騰速率(transpiration rate, Tr)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration, Ci)由儀器自動測得。測定時溫度(27 ± 2) ℃，光照強度1 300 μmol·(m2·s)?1，CO2濃度(380 ± 10) mg·L-1，每葉測定3 個值，計算平均值。

1.3.4 葉綠素熒光參數測定

分別取不同時間、不同濃度鹽處理后的尖葉石竹扦插幼苗各3 株，暗適應20 min 后，用葉綠素熒光分析儀(IMAGING-PAM，kinetic 模式)測定植株葉綠素熒光參數。先照射檢測光[< 0.05 μmol·(m2·s)?1]，隨后照射飽和脈沖光[8 000 μmol·(m2·s)?1]，測定PSⅡ的最大光化學效率(Fv/ Fm)，每個處理重復3 次。

1.3.5 脫蠟處理后鹽脅迫下相對含水量和持水力測定

將尖葉石竹蠟質突變體與野生型幼苗葉片分別在氯仿(CHCl3)溶液中浸泡30 s 進行脫蠟處理，然后再將脫蠟的幼苗分別在0、50、100、150、200、250和300 mmol·L?1濃度NaCl 溶液中處理24 h，測定脫蠟材料葉片的相對含水量和持水力，測定方法同上。

1.4 數據分析

應用Excel 2010 對數據進行整理，并用Origin 2018 繪圖，應用SPSS 19.0 結合Tukey 分析方法，對同一處理下尖葉石竹蠟質突變體與野生型之間的生理指標數值進行差異顯著性分析(P< 0.05)。

2 結果與分析

2.1 尖葉石竹野生型和蠟質突變體的耐鹽表型和水分含量的比較

利用不同濃度(0～300 mmol·L?1)的NaCl 溶液對野生型和蠟質突變體扦插幼苗進行了處理。隨著NaCl 處理時間的延長及處理濃度的升高，相比于野生型，蠟質突變體的葉片萎蔫程度更小，葉片褪綠現象更弱。當NaCl 濃度在200 mmol·L?1時處理12 d后，蠟質突變體與野生型表型差異最為明顯，野生型幼苗已出現干枯死亡現象，而蠟質突變體幼苗顏色基本正常(圖1A)。水分含量分析顯示兩種材料葉片的相對含水量隨著處理濃度的升高均呈下降趨勢，且在NaCl 濃度為200、250 和300 mmol·L?1時蠟質突變體相對含水量顯著高于野生型(P< 0.05) (圖1B)；而兩種材料的葉片持水力則隨著處理濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢，當處理濃度達到150 mmol·L?1時兩種材料的葉片持水力達到最高(圖1C)。

圖1 NaCl 脅迫對尖葉石竹野生型和蠟質突變體生長表型、相對含水量和葉片持水力的影響Figure 1 Effects of NaCl stress on growth phenotype, relative water content, and water retention capacity of the wild-type and a waxy mutant of Dianthus spiculifolius

在不同時間(200 mmol·L?1，0～48 h)及不同濃度(0～300 mmol·L?1，24 h)的NaCl 處理下，蠟質突變體葉片的蒸騰速率普遍低于野生型葉片(圖2A 和圖2B)。表型和水分指標顯示蠟質突變體比野生型具有更高的耐鹽性，這可能與其更好的水分保持有關。

圖2 鹽脅迫對尖葉石竹野生型和蠟質突變體蒸騰速率的影響Figure 2 Effects of NaCl stress on transpiration rate of the wild-type and a waxy mutant of Dianthus spiculifolius

2.2 尖葉石竹野生型和蠟質突變體葉片的抗氧化酶活性和MDA 含量比較

不同時間NaCl 處理下野生型SOD 活性波動幅度較小，而蠟質突變體中SOD 活性呈緩慢上升趨勢。在200 mmol·L?1NaCl 處理0～6 h 內，野生型葉片SOD 活性顯著高于蠟質突變體(P< 0.05)，而12～48 h 內，兩者的SOD 活性無明顯差異(圖3A)。隨NaCl 濃度的升高，兩者SOD 活性均呈上升趨勢，整體上差異不明顯(圖3B)。POD 和CAT 活性在不同時間和不同濃度處理下均呈現先上升后下降的趨勢，而在不同濃度NaCl 處理下，蠟質突變體葉中兩種酶活性普遍高于野生型(圖3C?F)。MDA 含量分析顯示，在不同時間和不同濃度的NaCl 處理下，蠟質突變體葉中的MDA 含量均顯著低于野生型(P<0.05) (圖3G 和圖3H)。

圖3 鹽脅迫對尖葉石竹野生型和蠟質突變體抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響Figure 3 Effects of NaCl stress on the activity of antioxidant enzymes and MDA content of the wild-type and a waxy mutant of Dianthus spiculifolius

2.3 尖葉石竹野生型和蠟質突變體葉片中滲透調節物質含量、光合參數和葉綠素熒光參數比較

在不同時間處理下，兩種材料中的可溶性糖和脯氨酸含量隨處理時間延長呈先上升后下降趨勢，可溶性蛋白含量變化幅度較小，在正常條件和鹽處理下蠟質突變體葉中可溶性糖含量均顯著高于野生型(P< 0.05) (圖4A 和圖4B)，而在0～300 mmol·L?1NaCl 處理24 h以及200 mmol·L?1NaCl 處理0～24 h下蠟質突變體葉中可溶性蛋白含量則顯著低于野生型(P< 0.05) (圖4C 和圖4D)。在150～300 mmol·L?1NaCl 處理24 h 以及200 mmol·L?1NaCl 處理0～48 h下蠟質突變體葉中脯氨酸含量顯著高于野生型(P<0.05) (圖4E和圖4F)。

圖4 NaCl 脅迫對尖葉石竹野生型和蠟質突變體滲透調節物質含量的影響Figure 4 Effects of NaCl stress on the content of osmotic regulatory substances in the wild-type and a waxy mutant of Dianthus spiculifolius

在50～300 mmol·L?1NaCl 處理24 h 以及200 mmol·L?1NaCl 處理24 和48 h 下蠟質突變體葉中的凈光合速率顯著高于野生型(P< 0.05) (圖5A 和圖5B)，而在100～300 mmol·L?1NaCl 處理24 h 以及200 mmol·L?1NaCl 處理6～48 h下蠟質突變體葉中胞間CO2濃度顯著低于野生型(P< 0.05) (圖5E和圖5F)。對于氣孔導度指標，在不同處理時間(除48 h)上兩者無明顯差異，而在0～200 mmol·L?1NaCl處理24 h 下野生型的氣孔導度下降趨勢比蠟質突變體更大，而蠟質突變體葉中氣孔導度的下降趨勢較緩(圖5C 和圖5D)。

圖5 NaCl 脅迫對尖葉石竹野生型和蠟質突變體凈光合速率、氣孔導度和胞間CO2 濃度的影響Figure 5 Effects of NaCl stress on net photosynthetic rate, stomatal conductance, and intercellular CO2 concentration of the wild-type and a waxy mutant of Dianthus spiculifolius

葉綠素熒光參數Fv/Fm值的變化幅度大小能夠反映植物光合作用受抑制程度。NaCl 處理不同時間后，蠟質突變體和野生型葉的Fv/Fm值無明顯差異(圖6A)，而250 和300 mmol·L?1NaCl 處理下，蠟質突變體葉中的Fv/Fm值顯著高于野生型(P< 0.05)(圖6B)，表明在這個處理濃度下，蠟質突變體葉光合能力受鹽脅迫抑制的程度更小。

圖6 NaCl 脅迫對尖葉石竹野生型和蠟質突變體葉綠素熒光參數的影響Figure 6 Effects of NaCl stress on chlorophyll fluorescence parameters of the wild-type and a waxy mutant of Dianthus spiculifolius

2.4 脫蠟處理后尖葉石竹野生型和蠟質突變體水分含量的比較

為驗證表皮蠟質與植物保水能力的關系，對兩種材料脫蠟處理，脫蠟后的蠟質突變體與野生型在不同濃度NaCl 脅迫24 h 后，兩者葉片相對含水量和葉片持水力變化趨勢基本一致，且兩者無明顯差異(圖7A 和圖7B)，這與脫蠟前兩種材料的含水量變化不同，表明表皮蠟質的存在與蠟質突變體葉片保水能力直接相關。

圖7 鹽脅迫對脫蠟尖葉石竹野生型和蠟質突變體相對含水量和葉片持水力的影響Figure 7 Effects of NaCl stress on relative water content and water retention capacity of the wild-type and a waxy mutant of Dianthus spiculifolius after dewaxing

3 討論

3.1 植物表皮蠟質與鹽脅迫下水分維持的關系

不同環境、不同發育階段的植物，同時遭受多種生物和非生物脅迫時，表皮蠟質對增強植物在多重脅迫中的耐受性方面有直接作用[1]。鹽脅迫可對植物造成生理干旱，而表皮蠟質能夠限制水分蒸騰、維持水分含量的穩定。本研究發現在200～300 mmol·L?1NaCl 處理下蠟質突變體的葉片含水量顯著高于野生型葉片，而蒸騰速率顯著低于野生型葉片。蠟質突變體植株整體上表現出萎蔫程度更小、褪綠程度更弱等表型，說明蠟質突變體葉片在鹽脅迫下維持了更低的水分蒸騰而保持了更高的相對含水量，由此表現出更強的耐鹽表型。為證明表皮蠟質與水分維持間的直接關系，本研究利用氯仿溶液對野生型和蠟質突變體的葉片進行了脫蠟處理，而處理后的兩者葉片在鹽脅迫后的相對含水量則無顯著差異。這些結果說明蠟質突變體的高表皮蠟質含量是其鹽脅迫下維持更高含水量的直接原因。

3.2 植物表皮蠟質對鹽脅迫下葉片鹽應答生理指標的可能影響

植物通過保護酶系統清除多余的活性氧，盡可能減少由鹽脅迫引起的活性氧積累而對其自身的傷害。本研究中，蠟質突變體和野生型葉片在200和250 mmol·L?1NaCl 處理24 h 下的SOD 和POD 活性基本相同，無明顯差異，而蠟質突變體葉的CAT 活性在多種濃度的NaCl 處理下均普遍高于野生型葉片。當處理時間過長和鹽濃度過高時，POD、CAT 活性則呈現下降趨勢，推測可能是由于鹽濃度過高，超過植物本身的承受限度，破壞了POD 和CAT 的合成過程或生理活性。MDA 是膜脂過氧化的最終分解產物，其含量可以反映植物遭受脅迫傷害的程度。在野生型中，MDA 含量隨著NaCl 處理濃度的增加呈現先降低后升高的趨勢，當NaCl 濃度增加到200 mmol·L?1以上時，MDA 含量逐漸升高。這與蠟質突變體則有所不同，其MDA 含量始終維持了相對更低的水平。除保護酶外，滲透調節是植物適應鹽脅迫的基本策略之一。可溶性糖、可溶性蛋白和小分子有機化合物作為細胞內的重要組成，具有滲透調節的作用。它們在一定程度上可以維持細胞代謝穩定，保證細胞正常的生命活動。惠紅霞等[19]對枸杞(Lycium barbarum)的鹽脅迫試驗發現，鹽脅迫可以抑制光合作用，致使可溶性糖含量上升，這與本研究結果相一致。本研究中，可溶性蛋白和游離脯氨酸含量呈現出不同結果，可溶性蛋白含量隨鹽濃度升高并無顯著變化，說明短時間的鹽脅迫不會使尖葉石竹體內的可溶性蛋白發生顯著變化，然而葉片游離脯氨酸含量則隨著鹽濃度升高而升高，這與白榆(Ulmus pumila)[20]、中山杉(Taxodium hybrid)[21]的研究結果一致。然而，并不清楚表皮蠟質含量是如何影響抗氧化酶活性、MDA和滲透調節物含量的，推測其可能受到含水量高低的影響，水分是植物鮮重的重要組分和酶活性及功能的反應介質。

3.3 植物表皮蠟質對鹽脅迫下葉片光合參數的可能影響

鹽脅迫下，氣孔限制和非氣孔限制導致植物凈光合速率降低。氣孔限制是指鹽脅迫下植物葉肉細胞光合作用活躍進行，氣孔導度和胞間CO2濃度下降，造成細胞凈光合速率的下降。非氣孔限制是指因葉肉細胞光合能力較弱導致的凈光合速率下降，這種情況下氣孔導度的下降不會對其造成太大的影響[22]。在暗反應中，酶活性下降導致細胞本身的光合能力下降，這種現象是非氣孔限制因素造成的[23]。本研究中，鹽脅迫下蠟質突變體葉片的凈光合速率顯著高于野生型葉片，而且高濃度鹽脅迫(250 和300 mmol·L?1NaCl)下蠟質突變體葉片維持了更高的Fv/Fm值，說明蠟質突變體在鹽脅迫下維持了更高的光合能力，這可能與其更高的可溶性糖含量直接相關。

4 結論

綜上所述，本研究結果顯示尖葉石竹蠟質突變體對鹽脅迫的抗性強于野生型，這可能與表皮蠟質限制了脅迫過程中水分的損失直接相關，而鹽脅迫下更高的水分保持可能又間接影響鹽應答生理指標的變化和光合能力。總之，本研究結果對尖葉石竹蠟質突變體在鹽脅迫條件下的擴大應用提供了幫助。