喙尾琵琶甲乙醇提取物對環磷酰胺致小鼠卵巢早衰的保護作用

王欽?司華新?伏蓉?孔彩華?劉克娜?隋世燕

【摘要】目的 研究喙尾琵琶甲乙醇提取物（BRFAE）對環磷酰胺誘導的卵巢早衰小鼠的保護作用，初步探索沉默信息調節因子1 /腫瘤相關蛋白53 （SIRT1/p53）信號通路在此過程中的作用。方法 將40只無特定病原體級雌性KM小鼠隨機分為對照組、模型組和BRFAE低劑量和高劑量組。模型組和BRFAE低、高劑量組予腹腔注射環磷酰胺160 mg/kg，對照組則注射等體積的生理鹽水，次日對照組和模型組予生理鹽水灌胃，BRFAE低、高劑量組分別予BRFAE 100、200 mg/kg灌胃，連續14 d。干預結束后采集小鼠血液檢測小鼠血漿丙二醛、一氧化氮和超氧化物歧化酶（SOD）水平，摘取卵巢稱重并制作HE切片進行卵泡計數，同時檢測卵巢組織中SIRT1和p53 mRNA及蛋白表達。結果 低、高劑量的BRFAE均能改善環磷酰胺導致的卵巢增重和卵巢指數降低（P均<0.01），增加原始、初級卵泡和各級卵泡總數并減少閉鎖卵泡的數量（P均< 0.05），其卵巢體積增大、黃體纖維化和血管減少，一氧化氮和丙二醛的水平降低，SOD活力升高（P均< 0.01），且高劑量BRFAE各項指標改善效果比低劑量BRFAE更為明顯（P均<0.05）。免疫組織化學染色顯示，與對照組相比，模型組SIRT1蛋白表達減弱（P < 0.01），而p53蛋白表達增強（P < 0.01），經BRFAE治療后SIRT1蛋白表達增強（P < 0.01），而p53蛋白表達減弱（P < 0.01）。SIRT1和p53的qPCR檢測結果與免疫組織化學染色結果基本一致。結論 BRFAE能夠通過抗氧化作用抑制環磷酰胺所致的小鼠卵巢早衰，SIRT1/p53信號通路可能參與了其抗卵巢早衰作用。

【關鍵詞】喙尾琵琶甲乙醇提取物;SIRT1/p53通路;KM小鼠;卵巢早衰

Protective effect of Blaps Rynchopetera Fairmaire alcohol extract on cyclophosphamide-induced premature ovarian failure in mice Wang Qin， Si Huaxin， Fu Rong， Kong Caihua， Liu Kena， Sui Shiyan. School of Public Health， Dali University， Dali 671000， China

Corresponding author， Sui Shiyan， E-mail： sysui569@163.com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of Blaps Rynchopetera Fairmaire alcohol extract （BRFAE） on cyclophosphamide （CP）-induced premature ovarian failure in mouse models and investigate the role of SIRT1/p53 signaling pathway in this process. Methods Forty SPF female KM mice were randomly divided into the control， model， low- and high-dose BRFAE groups. Mice in the model， low- and high-dose BRFAE groups were given with CP at a dose of 160 mg/kg， and those in the control group were given with normal saline. On the next day， mice in the control and model groups were intragastrically administered with normal saline， and those in the low- and high-dose BRFAE groups were intragastrically administered with BRFAE （100 mg/kg and 200 mg/kg） for 14 consecutive d. After intragastric administration， mouse plasma samples were taken to detect the levels of malondialdehyde （MDA）， nitric oxide （NO） and superoxide dismutase （SOD）. The ovarian tissues were collected， weighed and prepared for HE staining. The quantity of follicles was counted. The expression levels of SIRT1 and p53 mRNA and proteins in the ovarian tissues were also determined. Results Administration of low- and high-dose BRFAE significantly improved the CP-induced increase in ovarian weight and the reduction of ovarian index （all P < 0.01）， significantly increased the total quantity of primitive， primary and all stages of follicles， and significantly reduced the quantity of atretic follicles （all P < 0.05）. In both low- and high-dose BRFAE groups， the ovarian volume was significantly increased， the corpus luteum fibrosis and blood vessels were significantly decreased， the NO and MDA levels were significantly declined， and the activity of SOD enzyme was significantly elevated （all P < 0.001）. The improvement effect of high-dose BRFAE was more pronounced compared with that of low-dose BRFAE （all P <

0.05）. The results of immunohistochemistry showed that compared with the control group， the expression level of SIRT1 protein in the model group was significantly down-regulated （P < 0.01）， whereas that of p53 protein was significantly up-regulated （P < 0.01）. After BRFAE treatment， the expression level of SIRT1 was significantly up-regulated （P < 0.01）， whereas that of p53 was significantly down-regulated （P < 0.01）. The expression levels of SIRT1 and p53 mRNA detected by q-PCR were basically consistent with the results of immunohistochemistry. Conclusion BRFAE inhibits CP-induced premature ovarian failure in mice through its antioxidant effect， and the SIRT1/p53 signaling pathway may be involved in its anti-premature ovarian failure effect.

【Key words】Blaps Rynchopetera Fairmaire alcohol extract; SIRT1/p53 signaling pathway;

KM mouse; Premature ovarian failure

卵巢早衰指婦女40歲之前由于某些原因引起的卵巢功能衰竭，其表現有閉經、不育、雌激素缺乏，以及促性腺激素水平升高[1]。據統計，近幾年來卵巢早衰的發病率在1%～3%[2]。無論哪種原因導致的卵巢早衰，在前期均會產生顆粒細胞的凋亡[3]。氧化應激即抗氧化系統的平衡被破壞[4]。女性衰老、肥胖等因素可引起女性卵巢氧化應激，進而誘導其卵巢顆粒細胞的凋亡，導致卵巢早

衰[5-7]。因此，尋找一種能夠減輕人卵巢氧化應激引起的顆粒細胞凋亡進而抑制卵巢早衰的抗氧化物質對改善卵巢功能有重要意義。喙尾琵琶甲（BRF）是一種攜帶臭味的昆蟲，大多分布在云南滇中、滇東高原，俗稱打屁蟲，其活性成分含量頗豐，藥用價值較高[8]。肖懷[9]研究發現BRF具有顯著的抗氧化活性成分。前期研究發現BRF流浸膏能夠改善亞硝酸鹽所致雄性小鼠生殖損傷，保護機制與抗氧化密切相關，但是其分子機制還不清楚，筆者尚未見報道BRF與卵巢早衰相關的機制研究。沉默信息調節因子1（SIRT1）是一種組蛋白去乙酰化酶[10]。SIRT1可以通過使腫瘤相關蛋白53 （p53）去乙酰化，降低其表達進而抑制細胞衰老反應[11]。但是，BRFAE是否通過影響SIRT1/p53通路抑制小鼠卵巢早衰有待進一步研究。為此，本研究探討BRF乙醇提取物（BRFAE）對環磷酰胺誘導的卵巢早衰小鼠的保護作用，并觀察SIRT1/p53信號通路在此過程中的作用，現報告如下。

材料與方法

一、實驗動物

SPF級雌性KM小鼠，6周齡，體質量22～25 g，根據預實驗結果確定樣本量為40只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[小鼠生產許可證號：SCXK（湘）2019-004，大理大學實驗動物使用許可證號：SYXK（滇）2018-0002]。實驗動物處死和組織取樣按照《實驗動物福利倫理審查指南GB/T 35892-2018》進行。

二、試 劑

BRFAE由成年BRF鮮蟲或干蟲（批號202102 21-7）粉碎后加95%的乙醇冷浸提取4次后去脂，-20℃冷凍備用。環磷酰胺購自江蘇恒瑞醫藥，丙二醛、一氧化氮、超氧化物歧化酶（SOD）、BCA蛋白濃度測定試劑盒和一抗稀釋液購自碧云天生物，SIRT1和p53兔多抗（稀釋比例均為1∶50）及兔二抗（稀釋比例均為1∶500）購自美國Bioworld Technology，TRIzol試劑購自美國Life Technologies，實時定量PCR（q-PCR）試劑盒購自上海普洛麥格生物，含SYBR Green DNA聚合酶的PCR試劑盒購自北京天根生化科技，10%水合氯醛麻醉劑和10%中性甲醛固定液購自北京雷根生物技術，肝素鈉購自北京索萊寶。引物由蘇州金唯智生物公司合成。

三、方 法

1.造模及給藥

小鼠適應性飼養1周后，隨機分為4組：對照組、模型組、BRFAE低劑量和BRFAE高劑量組（治療組），每組各10只。實驗開始時，模型組和BRFAE組予腹腔注射環磷酰胺160 mg/kg，對照組則注射等體積的生理鹽水。第2日對照組和模型組小鼠予生理鹽水灌胃，治療組予BRFAE灌胃，低、高劑量分別為100 mg/kg和200 mg/kg[12]。連續灌胃14 d，每日記錄小鼠日常行為（包括毛發、情緒、進食、飲水、二便及應激等）。

2. 血清氧化、抗氧化指標檢測

實驗結束后，小鼠禁食24 h，腹腔注射水合氯醛麻醉后眼球采血（肝素鈉抗凝），1000×g離心10 min，吸取上清，根據試劑盒說明書測定血清中SOD、一氧化氮和丙二醛的水平。

3. 卵泡計數和免疫組織化學染色（IHC）

頸部脫臼處死小鼠后，摘取小鼠雙側卵巢用于計算卵巢指數（雙側卵巢質量/體質量，mg/g），每組選取5個卵巢進行固定，每個卵巢制作成5個層面，HE染色后雙人盲法閱片，分別計數原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡和成熟卵泡的數目，最后計數各級卵泡的總數和閉鎖卵泡數;其余卵巢組織置于-80℃冰箱凍存備用。使用SIRT1和p53抗體進行IHC染色，顯微鏡下觀察并統計陽性結果（特定區域內的棕黃色被視為陽性）。按說明書應用Image-Pro Plus 6.0計算陽性組織的校正累積光密度值，并以此為蛋白相對表達量[13]。

4. q-PCR

使用TRIzol試劑提取卵巢組織的總RNA，并用2 μg 總RNA進行了逆轉錄。PCR反應體系：2.5 μL cDNA，1.5 μL目的RNA或內參RNA上下游引物，8 μL RNase-free ddH2O，0.5 μL 50倍稀釋的ROX 參比染料，12.5 μL含SYBR Green的DNA聚合酶，共25 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性15 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸32 s，共40個循環[14]。使用2-ΔΔCt法分析PCR結果[15]。SIRT1引物序列為上游5’-CCAGACCTCCCAGACCCTCAAG-3’，下游5’-G

TGACACAGAGACGGCTGGAAC-3’，產物長度

120 bp;p53引物序列為上游5’-GGAAGCCGCCG

AAGAAGATGAG-3’，下游5’-GCTATCATTGCTCT

CCGTGTCCTC-3’，產物長度82 bp;內參GAPDH引物序列為上游5’-AGGTTGTCTCCTGCGACTTCA-

3’，下游5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’，產物長度184 bp。

四、統計學處理

使用SPSS 21.0處理數據。定量資料以表示，多組比較行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P < 0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、BRFAE對卵巢早衰模型小鼠體質量、卵巢質量和卵巢指數的影響

實驗開始和實驗結束時4組小鼠的體質量比較差異均無統計學意義（F值分別為0.106、0.129，P均> 0.05）。與對照組相比，模型組小鼠的卵巢質量和卵巢指數均減少（P均< 0.01）;與模型組相比，2個治療組小鼠的卵巢質量和卵巢指數均增加（P均< 0.01），且2個治療組之間及其與對照組比較差異均無統計學意義（P均> 0.05），見圖1。

二、BRFAE對卵巢早衰模型小鼠卵巢形態改變和卵泡數量的影響

與對照組相比，模型組小鼠卵巢體積減小、形態不規則，且黃體纖維化嚴重、血管較少、各級卵泡明顯較少，經低、高劑量BRFAE治療后，小鼠卵巢均有不同程度的恢復，其原始卵泡和各級卵泡總數均有所增加（P均< 0.01），高劑量的BRFAE還能增加初級卵泡的數目（P < 0.05）。從卵巢大小而言，BRFAE高劑量組的恢復比低劑量組更為顯著。模型組的原始卵泡數、初級卵泡數和各級卵泡總數均低于對照組，而閉鎖卵泡數多于對照組（P < 0.01），見圖2、3。

三、BRFAE對卵巢早衰模型小鼠血清脂質氧化指標和抗氧化指標的影響

與對照組相比，模型組小鼠血清中一氧化氮和丙二醛水平升高（P均< 0.01），而SOD活力降低（P < 0.01）。經低、高劑量的BRFAE治療后，2個治療組的一氧化氮和丙二醛水平均降低（P均<

0.01），而SOD活力升高（P均< 0.01），且高劑量組降低丙二醛的效果優于低劑量組（P < 0.01），見圖4。

四、BRFAE對卵巢早衰模型小鼠卵巢組織SIRT1和p53蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組小鼠卵巢SIRT1蛋白表達下調且卵巢被環磷酰胺破壞嚴重未見各級卵泡形態，而經BRFAE治療后，SIRT1蛋白表達上調，并且強于模型組。與BRFAE低劑量組比較，高劑量組的SIRT1蛋白表達增強更顯著。與對照組相比，模型組p53蛋白表達顯著上調，而BRFAE治療后，2個治療組的p53蛋白表達均低于模型組，高劑量組的p53表達下調效果比低劑量組更顯著（P < 0.01），且與對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖5。

五、BRFAE對卵巢早衰模型小鼠卵巢組織SIRT1和p53 mRNA表達的影響

4組小鼠卵巢組織SIRT1和p53的mRNA表達與各自蛋白表達結果基本一致。與對照組相比，模型組SIRT1 mRNA相對表達量下調（P < 0.01），而經BRFAE治療后，2個治療組的SIRT1 mRNA相對表達量均高于模型組（P均< 0.01），高劑量組高于低劑量組和對照組（P均< 0.01）。與對照組相比，模型組p53 mRNA相對表達量上調（P <

0.01），而經BRFAE治療后，2個治療組的p53 mRNA相對表達量均低于模型組（P均< 0.01），且高劑量組低于低劑量組，2組與對照組比較差異均無統計學意義（P均> 0.05），見圖6。

討 論

由于體外細胞實驗存在一些限制，如動物激素水平無法測量、動物行為狀態無法觀察等，因此我們建立卵巢早衰動物模型進一步探討抗氧化物質BRFAE抵抗小鼠卵巢早衰的作用及其機制。有報道，患者在使用環磷酰胺后會出現卵巢儲備功能下降相關的不良反應，部分患者甚至出現卵巢早衰，因此環磷酰胺常被用于動物卵巢早衰模型的建立 [1， 12， 16] 。本研究中，模型組與對照組相比，卵巢質量和卵巢指數降低、卵巢體積變小且形態不規則、黃體纖維化嚴重、血管減少、各級健康卵泡數目明顯較少而閉鎖卵泡數明顯增加，與谷毅鵬等[17]的研究結果一致。

一氧化氮、丙二醛和SOD常用于評價機體內氧化或抗氧化應激水平[18]。本研究顯示，BRFAE能降低小鼠血清中一氧化氮和丙二醛水平且可提高小鼠血清SOD活力，表明天然物質BRFAE具有顯著的抵抗環磷酰胺致小鼠氧化損傷的能力。

SIRT1所介導的一些信號通路在延緩卵巢衰老方面發揮著重要作用[19]。SIRT1的下游基因p53能夠促進顆粒細胞凋亡，進而誘導卵巢衰老[20]。有研究者報道，在環磷酰胺所致大鼠氧化應激的狀態下，卵巢顆粒細胞凋亡增加，SIRT1的表達下調而p53的表達則上調，白藜蘆醇處理后可以抑制此表現[21]。這與本研究BRFAE的治療效果相一致，模型組SIRT1蛋白低表達而p53蛋白高表達，而經BRFAE治療后，SIRT1蛋白表達上調而p53蛋白表達下調。mRNA結果與蛋白結果基本一致，高劑量組作用比低劑量組更為明顯。

綜上所述，BRFAE能夠通過抗氧化作用抑制環磷酰胺所致的小鼠卵巢早衰，SIRT1/p53信號通路可能參與了其抗卵巢早衰作用。BRFAE抑制環磷酰胺所致的小鼠卵巢早衰量效關系尚需日后進一步研究明確。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-04-30）

（本文編輯：林燕薇）